(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006)

百香果(PassifloraeduliaSims)又名雞蛋果、西番蓮、巴西果，為西番蓮科西番蓮屬多年生藤本植物。全球已發(fā)現(xiàn)超過500個(gè)品種，其中可供食用的有20個(gè)品種，多數(shù)栽培種為黃百香果(P.edulisvar.flovioarpaDegener)、紫百香果(P.edulisSims)等。因其果實(shí)多汁，且能散發(fā)出芒果、草莓、香蕉、蘋果、菠蘿等多種水果的香味，故有“果汁之王”的美譽(yù)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

百香果除具有一般水果的特性，還具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。鄧博一等研究表明，每100 mL百香果果汁中含有21.23 mg維生素C和65.00 mg蛋白質(zhì)；每100 g果肉中含有兒童生長發(fā)育必需氨基酸組氨酸28.05 mg和精氨酸3.94 mg，必需氨基酸蘇氨酸9.43 mg，纈氨酸6.63 mg，蛋氨酸0.56 mg，賴氨酸8.27 mg，異亮氨酸6.92 mg，亮氨酸6.43 mg，苯丙氨酸5.61 mg，大量元素Ca 508.54 mg，Mg 21.22 mg，微量元素Fe 0.39 mg，Mn 0.11 mg，Zn 0.46 mg[1]。此外，百香果中還含有多種生物活性物質(zhì)，主要包括黃酮類化合物如異葒草素、木犀草素、芹菜素、山奈酚等[2-3]，油脂如脂肪酸、不飽和烴類等[4]。黃酮類化合物是百香果中的重要化學(xué)成分。Deng等[5]采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus-maze test,EPM)和自發(fā)活動(dòng)測定試驗(yàn)(spontaneous activity test,SA)，分別測定了百香果乙醇、正丁醇及水等提取物對小鼠的影響，結(jié)果表明低劑量時(shí)表現(xiàn)為抗焦慮特性，高劑量時(shí)表現(xiàn)為鎮(zhèn)靜特性。采用核磁共振技術(shù)對提取物進(jìn)行鑒定分析表明，乙醇提取物為異葒草素。Farid等[6]對33 名膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthritis,OA)患者在服用百香果果皮提取物30 d和60 d分別評估其骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)，發(fā)現(xiàn)服用百香果果皮提取物的患者較對照組其疼痛、僵直等指數(shù)均顯著降低，結(jié)果表明，百香果果皮中的黃酮類化合物具有抗氧化和抗炎癥的功效。

采用第2代Illumina高通量測序技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)獲取并分析海量數(shù)據(jù)。近年來，利用這一技術(shù)已成功發(fā)掘和鑒定了多種植物與生理過程、生長發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物生物合成的相關(guān)基因。趙德剛等[7]對10年以上樹齡的杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)雌雄株轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析比對，研究杜仲雌雄株之間的基因表達(dá)差異。Zhang等[8]對茯苓(Wolfiporiacocos)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，獲得了與茯苓次生代謝產(chǎn)物三萜類物質(zhì)合成和菌核生長發(fā)育的相關(guān)基因。本研究以百香果果皮和果肉為主要研究對象，通過對3個(gè)不同品種的百香果轉(zhuǎn)錄組測序和分析，可以有效發(fā)掘和鑒定百香果次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的編碼基因及代謝調(diào)控相關(guān)基因，為克隆開發(fā)百香果重要功能基因奠定基礎(chǔ)，及通過生物工程手段提高百香果藥用成分含量、選育高品質(zhì)百香果、規(guī)范化種植和質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以黃果、滿天星和紫果3個(gè)不同品種百香果果皮和果肉為轉(zhuǎn)錄組測序材料。

1.2 樣品處理及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析流程

樣品RNA提取、文庫構(gòu)建、庫檢、上機(jī)測序，委托美因基因公司完成。獲得的測序結(jié)果，進(jìn)行了如圖1所示的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)不同品種百香果轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)量及組裝質(zhì)量分析

對黃果、滿天星、紫果3個(gè)百香果品種果皮和果肉部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序后，分別獲得黃果果皮47 875 830條、果肉44 325 678條，滿天星果皮47 019 772條、果肉45 472 434條，紫果果皮48 789 846條、果肉49 372 968條Clean reads片段，包含黃果果皮7 181 374 500 nt、果肉6 648 851 700 nt，滿天星果皮7 052 965 800 nt、果肉6 820 865 100 nt，紫果果皮7 318 476 900 nt、果肉7 405 945 200 nt核苷酸序列信息，序列長度大于20個(gè)核苷酸序列(Q 20)值分別為黃果果皮98.13%、果肉98.00%，滿天星果皮97.67%、果肉97.37%，紫果果皮96.96%、果肉98.17%，中間未知序列片段(N%)均為0.00%，GC核苷酸含量(GC%)分別為黃果果皮45.05%、果肉46.23%，滿天星果皮45.39%、果肉45.71%，紫果果皮46.04%、果肉45.93% (表1)。測序結(jié)果可用于數(shù)據(jù)組裝。

表1 百香果黃果、滿天星和紫果轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)量分析

樣品總原始讀數(shù)總讀數(shù)核苷酸序列總長度/ntQ20/%N/%GC/%黃果果皮5033138247875830718137450098.130.0045.05黃果果肉4578153144325678664885170098.000.0046.23滿天星果皮4893625447019772705296580097.670.0045.39滿天星果肉4639598445472434682086510097.370.0045.71紫果果皮4998831848789846731847690096.960.0046.04紫果果肉5016257449372968740594520098.170.0045.93

圖2 百香果黃果轉(zhuǎn)錄組的Unigene數(shù)據(jù)長度分布圖

圖3 百香果滿天星轉(zhuǎn)錄組的Unigene數(shù)據(jù)長度分布圖

使用Trinity軟件(https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki)對黃果、滿天星和紫果的Clean reads片段進(jìn)行拼接，獲得黃果34 968條、滿天星41 896條、紫果41 701條Unigene片段。其中黃果長度300～500 nt的Unigene片段11 368條，500～1 000 nt 8 029條，1 000～2 000 nt 6540條，大于2 000 nt的9 031條，平均長度1 487 nt；滿天星長度300～500 nt的Unigene片段16 098條，500～1 000 nt 9 967條，1 000～2 000 nt 6 573條，大于2 000 nt的9 258條，平均長度1 361 nt；紫果長度300～500 nt的Unigene片段14 291條，500～1 000 nt的10 557條，1 000～2 000 nt的7 530條，大于2 000 nt的9 323條，平均長度1 329 nt。黃果、滿天星和紫果Unigene長度分布見圖2，圖3，圖4。綜合所有樣品，最終拼接組裝獲得78 583條All Unigene片段，平均長度1 668 nt，核苷酸序列總長度131 135 737 nt，N 50為3 047 nt (表2)，其長度為300～500 nt 24 934條，500～1 000 nt 16 641條，1 000～2 000 nt 13 229條，大于2 000 nt的23 779條(圖5)。

2.2 差異表達(dá)基因篩選

使用DESeq軟件進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)(Fold Change) ≥2或差異倍數(shù)≤1/2且錯(cuò)誤發(fā)生率(False Discovery Rate,FDR)<0.01，不同樣品間差異基因個(gè)數(shù)如圖6所示。

圖6 差異基因維恩圖

圖5 百香果黃果、滿天星和紫果轉(zhuǎn)錄組的All Unigene數(shù)據(jù)長度分布圖

2.3 差異基因GO富集與KEGG富集分析

使用topGO軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的Gene Ontology (GO)富集分析，統(tǒng)計(jì)方法為KS-檢驗(yàn)(Kolmogorov-Smirnov test)，結(jié)果如圖7所示。在生物過程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3大類別上，黃果、滿天星和紫果間差異基因均有分布。黃果與滿天星差異基因主要集中在乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(acetylglucosaminyltransferase)，代謝過程(metabolic process)，膜(membrane)，水解酶活性(hydrolase activity)等條目中；黃果與紫果差異基因主要分布在氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)，催化活性(catalytic activity)，分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex)，氧化還原過程(oxidation-reduction process)，代謝過程(metabolic process)等條目中；黃果與滿天星差異基因主要集中在DNA整合(DNA integration)，氧化還原過程，細(xì)胞內(nèi)(intracellular)，核糖體(ribosome)，氧化還原酶活性等條目中。

通過差異表達(dá)基因的通路(Pathway)顯著性富集分析，以KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫中Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。結(jié)果如圖8所示。黃果與滿天星在氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)，吞噬體(Phagosome)，植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)，核糖體內(nèi)化(Ribosome)通路均有差異表達(dá)基因富集，其中在Phagosome通路富集因子(Enrichment Factor)和log10(Q value)值均最大，表明差異表達(dá)基因在Phagosome通路中富集可能性最高，且富集顯著性越可靠，可見黃果與滿天星在細(xì)胞胞吞作用過程中存在較大差異。黃果與紫果在玉米素生物合成(Zeatin biosynthesis)，賴氨酸生物合成(Lysine biosynthesis)，纈氨酸生物合成(Valine)，亮氨酸和異亮氨酸生物合成(leucine and isoleucine biosynthesis)，糖酵解(Glycolysis/Gluconeogenesis)等通路富集有差異基因，其中Zeatin biosynthesis通路富集因子和log10值均較高，在Glycolysis/Gluconeogenesis通路富集因子雖較低，但log10值較高，表明黃果和紫果在玉米素生物合成和糖酵解等途徑中存在較大差異。滿天星與紫果在C 5分枝二元酸代謝(C 5-Branched dibasic acid metabolism)，花生四烯酸代謝Arachidonic acid metabolism，玉米素生物合成，核黃素代謝(Riboflavin metabolism)，維生素B6代謝(Vitamin B6metabolism)，賴氨酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成(Valine,leucine and isoleucine biosynthesis)等通路富集有差異基因，其中異亮氨酸生物合成通路富集因子和log10值均較高，表明滿天星和紫果在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成中存在較大差異。

注：縱坐標(biāo)為富集的GO term；橫坐標(biāo)為該term中差異基因個(gè)數(shù)。不同顏色用來區(qū)分生物過程、細(xì)胞組分和分子功能。圖7 GO富集柱狀圖

表2 百香果黃果、滿天星和紫果轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

樣品總條數(shù)總長度/nt平均長度/ntN50黃果349685200026314872624滿天星418965702159213612593紫果417015542508513292330所有樣品7858313113573716683047

注：圖中每個(gè)圖形表示1個(gè)KEGG通路?？v坐標(biāo)為 log10(Q value)值，縱坐標(biāo)越大，表示差異表達(dá)基因在該通路中的富集顯著性越可靠；橫坐標(biāo)為富集因子，富集因子越大，表示差異表達(dá)基因在該通路中的富集水平越顯著。圖8 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖

3 討 論

通過對黃果、滿天星和紫果3個(gè)不同百香果果皮及果肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得黃果果皮47 875 830條、果肉44 325 678條，滿天星果皮47 019 772條、果肉45 472 434條，紫果果皮48 789 846條、果肉49 372 968條Clean reads片段，拼接組裝后分別獲得平均長度為1 487 nt的黃果34 968條Unigene片段、平均長度為1 361 nt的滿天星41 896條Unigene片段和平均長度為1 329 nt的紫果41 701條Unigene片段。通過對差異表達(dá)基因的GO富集分析表明，黃果、滿天星和紫果在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三大類別上均分布有差異基因。KEGG富集分析表明，黃果與滿天星轉(zhuǎn)錄水平的差異主要集中在細(xì)胞胞吞作用、氧化磷酸化、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面；黃果與紫果轉(zhuǎn)錄水平的差異主要集中在玉米素生物合成，賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸4種人體必需氨基酸生物合成以及糖酵解途徑等方面；滿天星與紫果轉(zhuǎn)錄水平差異主要集中在脂肪酸、維生素代謝，玉米素生物合成，賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成等方面。

張弛等[9]針對大豆落花落莢問題，選取花器官脫落性質(zhì)存在差異的4個(gè)大豆(Glycinemax)栽培種花序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得原始數(shù)據(jù)20 GB，其中有效數(shù)據(jù)14.87 GB。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，少莢與多莢品種花序轉(zhuǎn)錄水平差異主要集中在脅迫應(yīng)答、物質(zhì)代謝、刺激應(yīng)答和病害抗性等方面，與脫落通路直接相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上并無顯著差異。蔣紅剛等[10]對“大紅袍”花椒(Zanthoxylumbungeamum)皮刺起始分化的莖尖節(jié)點(diǎn)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得56 242 196條數(shù)據(jù)片段，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝后，最終獲得45 057條Unigene片段，通過檢索注釋，找到參與植物形態(tài)發(fā)生的基因，如參與極軸分化的YABBY基因家族和響應(yīng)生長素濃度的ARF基因家族等，以期采用原位雜交技術(shù)研究花椒在皮刺分化過程中YABBY和ARF基因家族的表達(dá)情況，進(jìn)一步篩選獲得參與皮刺分化的關(guān)鍵基因，對關(guān)鍵基因進(jìn)行干擾或敲除，為培育品質(zhì)優(yōu)良的無刺花椒提供依據(jù)。

通過對黃果、滿天星和紫果3個(gè)不同品種百香果果皮及果肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，為百香果基因的分子克隆和功能鑒定研究提供了較好的數(shù)據(jù)支持，通過差異表達(dá)基因功能注釋，可為百香果氨基酸、黃酮類化合物和油脂等生物活性物質(zhì)的合成及代謝研究、關(guān)鍵酶基因的克隆、物質(zhì)的代謝調(diào)控以及百香果的優(yōu)良品種選育提供線索和依據(jù)。