李蒙

摘要：以苦皮藤素（Celastrus angulatus Maxim）根皮為原料，以苦皮藤素得率為指標(biāo)，對(duì)堿性蛋白酶、纖維素酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶4種酶輔助提取苦皮藤素的效果進(jìn)行比較分析，篩選出酶解效果較好的胃蛋白酶，再通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素的最佳工藝。結(jié)果表明，胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素在酶解溫度37 ℃、時(shí)間5 h、pH 2.0、加酶量66 000 U/g的條件下效果最好。

關(guān)鍵詞：酶法;苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）;苦皮藤素;提取

中圖分類號(hào)：Q55? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）06-0114-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.06.026? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Celangulin from the root skin of Celastrus angulatus were isolated using an enzye-assisted procedure. By analyzed the effects of alkaline protease， cellulase， pepsin and neutral protease on the extraction of celangulin， Pepsase was selected to optimize the extraction conditions. The results showed that the optimal conditions for celangulin extraction was found to be extraction with enzymatic hydrolysis with 66 000 U/g pepsase at 37 ℃ and pH 2 for 5 h. Under these conditions， the maximum yield of celangulin was obtained.

Key words： enzyme; Celastrus angulatus; celangulin; extraction

苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）系衛(wèi)科南蛇藤屬的一種多年生木質(zhì)藤本植物，是中國著名的具有開發(fā)潛力的殺蟲劑之一[1]。其含有的主要?dú)⑾x有效活性成分為苦皮藤素[2]，其防御病蟲害機(jī)理已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展[3，4]。傳統(tǒng)提取苦皮藤素的方法與工藝，如索氏提取、熱回流提取等已有研究[1，5]，而酶法輔助提取苦皮藤素鮮見報(bào)道。酶法輔助提取的原理是酶破壞細(xì)胞壁，整個(gè)過程反應(yīng)條件溫和，利用酶的專一性可避免對(duì)底物外物質(zhì)的破壞[6]。該法可以提高產(chǎn)率、縮短時(shí)間、降低成本。

本試驗(yàn)采用酶法輔助溶劑提取苦皮藤素，利用堿性、中性與胃蛋白酶、纖維素酶進(jìn)行輔助提取，優(yōu)化提取工藝，下一步將對(duì)苦皮藤素作為天然植物殺蟲劑的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，為市場(chǎng)開發(fā)植物源殺蟲劑苦皮藤素乳油提供依據(jù)?？嗥ぬ偎啬鼙婚_發(fā)利用，正是由于其對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，在環(huán)境中低殘留，在現(xiàn)階段其必將具有更廣闊的研究與應(yīng)用前景，更對(duì)秦巴山區(qū)植物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用有重要意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)材料? 苦皮藤根皮粉末：苦皮藤采集于陜西省商洛市黑龍口鎮(zhèn)，人工剝?nèi)】嗥ぬ俑ぃ帥鰲l件下風(fēng)干，粉碎機(jī)粉碎。

1.1.2? 試劑與儀器? 試劑：堿性蛋白酶（化學(xué)純）、中性蛋白酶（化學(xué)純）、胃蛋白酶（化學(xué)純）、纖維素酶（化學(xué)純），北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉（分析純）。儀器： 全自動(dòng)固液萃取儀（型號(hào)：B-811，步琦實(shí)驗(yàn)室設(shè)備貿(mào)易（上海）有限公司）、電子天平（型號(hào)：BSA223S，上海智泰電子科技有限公司）、恒溫水浴鍋（型號(hào)：HH-S，北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 苦皮藤素的提取? 參考文獻(xiàn)[2，6]的提取方法，稱取10.00 g苦皮藤根皮粉末，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL磷酸緩沖液煮沸5 min后過濾，以除去材料中的氧氣。向?yàn)V渣中加入酶液，在最適溫度水浴保溫靜置2 h，分別對(duì)苦皮藤根皮進(jìn)行酶解，然后酶失活后過濾，在濾渣中加入甲醇進(jìn)行提取，60 ℃提取6 h，浸提3次，過濾收集濾液，蒸發(fā)器處理濾液，稱苦皮藤素質(zhì)量。

1.2.2? 酶的篩選? 在提取所得的濾渣中加入100 mL磷酸緩沖液，按照表1加入酶液，用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，在最適溫度水浴靜置2 h，分別對(duì)苦皮藤根皮進(jìn)行酶解、提取，選擇得率最高的酶用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3? 酶法輔助提取單因素試驗(yàn)? 以苦皮藤素得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)酶解pH（1、2、3、4、5）、酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h）、酶解溫度（27、37、47、57、67 ℃）和加酶量（22 000、44 000、66 000、88 000、120 000 U/g）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的影響效果和最適范圍。

1.2.4? 酶法輔助提取正交試驗(yàn)? 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、加酶量作為考察因素，以苦皮藤素得率為考察指標(biāo)，通過4因素3水平正交試驗(yàn)（表2），進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.2.5? 苦皮藤素得率計(jì)算? 將干燥后的苦皮藤素稱質(zhì)量，計(jì)算得率，苦皮藤素得率（%）=苦皮藤素（g）/苦皮藤根皮樣品的質(zhì)量（g）×100。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 酶種類的選擇

在4種酶中，胃蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)苦皮藤素有較好的輔助提取效果，苦皮藤素得率分別為4.5%和4.2%，中性蛋白酶和纖維素酶輔助提取效果較差，得率分別為3.25%和3.16%（圖1），因此，選定胃蛋白酶為苦皮藤素輔助提取所用酶。

2.2? 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1? 酶解pH對(duì)提取效果的影響? 在酶解溫度37 ℃、加酶量22 000 U/g、酶解2 h條件下，不同pH所得苦皮藤素得率結(jié)果見圖2，pH 2對(duì)輔助提取苦皮藤素有較好的效果。

2.2.2? 酶解溫度對(duì)提取效果的影響? 在酶解2 h、加酶量22 000 U/g、pH 2條件下，不同酶解溫度所得苦皮藤素得率結(jié)果見圖3，37 ℃對(duì)輔助提取苦皮藤素有較好的效果。

2.2.3? 酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響? 在酶解溫度37 ℃、加酶量22 000 U/g、pH 2條件下，不同酶解時(shí)間所得苦皮藤素得率結(jié)果見圖4，酶解5 h對(duì)輔助提取苦皮藤素有較好的效果。

2.2.4? 加酶量對(duì)提取效果的影響? 在酶解溫度為37 ℃、時(shí)間2 h、pH 2條件下，不同加酶量所得苦皮藤素得率結(jié)果見圖5，加酶量44 000 U/g對(duì)輔助提取苦皮藤素有較好的效果。

2.3? 正交試驗(yàn)結(jié)果

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化胃蛋白酶輔助提取苦皮藤素工藝中的酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量和pH 4種因素。從表3可知，各因素對(duì)酶法輔助提取的影響效果為B>A>C>D，即酶解溫度對(duì)提取影響較為明顯，其次是酶解時(shí)間、加酶量和pH，試驗(yàn)最佳組合為A3B2C3D2，即酶解5 h，酶解溫度37 ℃，加酶量為66 000 U/g，酶解pH 2時(shí)，酶法輔助提取苦皮藤素得率為5.12%。

3? 小結(jié)與討論

在環(huán)境越來越受到人們關(guān)注的21世紀(jì)，對(duì)病蟲害治理，人們一直在尋找對(duì)人畜無害或低毒的植物源殺蟲劑，可以替代有害殘留的化學(xué)藥劑，許多植物次生代謝物質(zhì)對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲具有毒殺等生理學(xué)功能。較早就以苦皮藤為原料，提取分離出具有殺蟲活性的苦皮藤素[7，8]，后續(xù)對(duì)其提取及工藝、殺蟲機(jī)理等都展開了一系列研究，尤其以吳文君等[9，11]、張繼文等[10]以浸提、層析等分離技術(shù)對(duì)苦皮藤素化合物展開的研究較為深入，后續(xù)也有以回流提取[12]、浸漬提取方法[2]的展開，但酶法輔助提取苦皮藤素的工藝鮮見報(bào)道。

酶法輔助提取過程中酶解pH、時(shí)間、溫度及加酶量對(duì)苦皮藤素得率具有影響。通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)表明，在酶解5 h，酶解溫度37 ℃，加酶量為66 000 U/g，酶解pH 2時(shí)，酶法輔助提取苦皮藤素得率最大為5.12%。雖然酶法輔助提取沒有復(fù)雜的操作過程，但酶的成本較高，與傳統(tǒng)回流提取方法[12]并無明顯差異，出現(xiàn)這種可能有多種因素，提取過程中苦皮藤素可能被酶解，酶解pH可能導(dǎo)致苦皮藤素溶解性降低等，因此，探索更加高效的苦皮藤素提取方式將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 魏亞麗，吳鳴建，趙天增.值植物源殺蟲劑苦皮藤素的提取新工藝研究[J].河南科學(xué)，2008，26（1）：31-34.

[2] 黃四平，常? 丹，王小利，等.浸漬法提取苦皮藤素的工藝條件研究[J].應(yīng)用化學(xué)，2015，44（1）：85-91.

[3] 沈建國，翟海枝，林奇英，等.我國植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，31（1）：26-31.

[4] 姬志勤，胡兆農(nóng)，劉國強(qiáng)，等.衛(wèi)矛科植物苦皮藤殺蟲成分化學(xué)研究新進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（4）：748-752.

[5] 王國亮，南? 蓬，龔復(fù)俊，等.昆蟲拒食劑新資源—苦皮藤果油的化學(xué)成分研究初報(bào)[J].武漢植物學(xué)研究，1989，7（3）：301-302.

[6] 李紅嬌，李巨秀，趙? 忠.酶法輔助提取山杏種皮黑色素工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性[J].食品科學(xué)，2016，37（10）：69-75.

[7] WAKABAYASHI N，WU W J，WATERS R M，et al. Celangulin：A nonalkaloidal insect antifeedant from chinese bittersweet，celastrus angulatus[J].Journal of natural products，1988，51（3）：537-542.

[8] 劉慧霞，吳文君，王美珍.苦皮藤根皮的紅外光譜特征及其在鑒別中的應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報(bào)，1988，18（2）：305-310.

[9] 吳文君，王明安，朱靖博，等.殺蟲植物苦皮藤毒殺成分的研究[J].有機(jī)化學(xué)，2002，22（9）：631-637.

[10] 張繼文，吳文君，田? 暄.苦皮藤素類似物的合成與結(jié)構(gòu)鑒定[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，6（3）：21-25.

[11] 吳文君，胡兆農(nóng)，劉惠霞，等.苦皮藤主要?dú)⑾x有效成分的殺蟲作用機(jī)理及其應(yīng)用[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2005，48（5）：770-777.

[12] 黃四平，楊? 光，王小利，等.苦皮藤素的提取、鑒定與殺蟲效果實(shí)驗(yàn)研究[J].應(yīng)用化工，2015，44（12）：2193-2198.