吳逍風(fēng)　李奉喜　黃道來　李貴彬　龐森　陳俊　黃精樂

【摘要】 目的 探討特異性miRNA與胃癌預(yù)后相關(guān)性。方法 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載203例胃癌及24個(gè)癌旁組織miRNA和mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床資料。應(yīng)用 “edgeR”R包分別對(duì)比分析癌與癌旁樣本miRNAs及mRNA差異性。結(jié)合生存資料， 采用KM曲線法進(jìn)行差異miRNAs及靶基因生存分析。針對(duì)篩選出的靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析及GO功能注釋。結(jié)果 miRNA生存分析結(jié)果表明， miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944與胃癌患者生存時(shí)間密切相關(guān)。KEGG通路和GO功能分析結(jié)果表明， 靶基因主要富集在“pathways in cancer”“MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等腫瘤相關(guān)通路。結(jié)論 篩選出關(guān)鍵miRNA及其靶mRNA與胃癌發(fā)生、預(yù)后密切相關(guān)， 可作為新的潛在的治療靶點(diǎn)和檢測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 胃癌;miRNA;預(yù)后;生物標(biāo)志物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.09.019

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一， 2012年WHO資料統(tǒng)計(jì)全球每年胃癌新發(fā)病例超過95萬例， 每年因胃癌死亡的人數(shù)超過72萬人， 病死率占惡性腫瘤的第三位[1]。

2015年我國(guó)癌癥登記中心資料顯示， 胃癌發(fā)病率與死亡率逐年升高， 僅次于肺癌[2]。近年來， 隨著胃癌早期診斷及治療的迅速發(fā)展， 早期胃癌的5年死亡率顯著下降， 而晚期胃癌的的5年死亡率仍高達(dá)30%～50%[3]。因此， 尋找胃癌診斷、治療及預(yù)后相關(guān)的新的潛在生物標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)。研究表明， miRNA可調(diào)控靶基因表達(dá)， 參與信號(hào)通路， 影響腫瘤發(fā)生發(fā)展， 發(fā)揮致癌或抑癌作用[4]。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌及其癌旁樣本RNA芯片數(shù)據(jù)， 探尋胃癌關(guān)鍵miRNA及其靶基因， 為胃癌診治、預(yù)后提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌及癌旁樣本miRNA及mRNA芯片數(shù)據(jù)， 同一樣本中只有mRNA或miRNA芯片數(shù)據(jù)的樣本不納入研究， 最終共納入203例胃癌樣本及24例癌旁樣本芯片資料。203例樣本均經(jīng)病理診斷確診為胃癌。

1. 2 胃癌miRNA及mRNA差異表達(dá)分析 收集樣本的RNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)， 調(diào)用R語言edgeR包對(duì)比分析胃癌與癌旁組織RNA表達(dá)差異性， 篩選出差異倍數(shù)（fold change， FC）>2倍且P<0.05的差異表達(dá)RNA。

1. 3 生存分析 結(jié)合胃癌患者RNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)及生存資料， 采用 KM曲線法繪制生存曲線， 分析miRNA及其靶基因與胃癌患者預(yù)后相關(guān)性， P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1. 4 胃癌miRNA靶基因篩選及其功能分析 基于篩選出的關(guān)鍵miRNA， 應(yīng)用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫（miRDB、miRTarBase和TargetScan）篩選靶mRNA。為增加靶mRNA的可信度， 同時(shí)檢索3個(gè)miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫， 靶mRNA需滿足以下條件：應(yīng)同時(shí)包含于3個(gè)數(shù)據(jù)庫中;并且是胃癌差異表達(dá)mRNA。采用KOBAS 3.0進(jìn)行靶基因KEGG信號(hào)通路富集及GO功能注釋分析。

2 結(jié)果

2. 1 胃癌患者臨床病理資料特征 胃癌患者平均年齡66歲， ≥66歲110例;<66歲93例。男性患者較女性多， 男女性別比約為1.57∶1。其中G3期患者占62.1%。

2. 2 胃癌特異性miRNA和mRNA差異分析 采用R包edgeR對(duì)比分析胃癌與癌旁樣本RNA表達(dá)差異， 滿足FC>2且 FDR<0.01的差異miRNAs 181個(gè)， 其中上調(diào)的147個(gè)， 下調(diào)的34個(gè)， mRNA 2516個(gè)， 其中上調(diào)的1335個(gè)， 下調(diào)的1181個(gè)。

2. 3 生存分析 應(yīng)用KM曲線法繪制胃癌特異性miRNA生存曲線， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17， miR-139， miR-323b， miR-365a， miR-551b， miR-7705， miR-877和miR-944等8個(gè)miRNA的差異表達(dá)與胃癌患者的生存時(shí)間密切相關(guān)。

2. 4 胃癌miRNA靶基因篩選及其功能分析 通過miRDB、miRTarBase和TargetScan， 檢索以上關(guān)鍵miRNA靶基因結(jié)果表明， 三個(gè)數(shù)據(jù)庫均能檢索到的靶基因494個(gè)， 其中有54靶基因?yàn)槲赴┎町惐磉_(dá)基因。采用KOBAS 3.0對(duì)54個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG通路及GO功能分析， 結(jié)果表明靶基因主要富集在“pathways in cancer”， “MicroRNAs in cancer”， “MAPK signaling pathway”， “cell cycle”以及“apoptosis”等腫瘤相關(guān)通路， 見表1;及“biological regulation”， “cell”， “cellular process”， “regulation of biological process”和“regulation of metabolic process”等功能關(guān)系密切， 見表2。另外， 生存分析結(jié)果表明， 靶基因ABCA1， DCC， FAM129A， KIF23， KPNA2， POLQ和TXNIP與胃癌患者的生存密切相關(guān)。

3 討論

目前， miRNA數(shù)據(jù)庫（miRbase）中收錄已識(shí)別的miRNA超過2500個(gè)， 與多種腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等相關(guān)。有研究表明， miRNA失調(diào)與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。miR-130， miR-1266， miR-1207-5P及miR-1182促使胃癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移[5， 6]。miR-15b， miR-16， miR-34， miR-181b， miR-181c和miR-497在胃癌中呈低表達(dá)， 促使基因BCL-2的表達(dá)， 抑制胃癌細(xì)胞凋亡[7]。miRNA與胃癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移等相關(guān)研究已取得一定的進(jìn)展， 而與胃癌預(yù)后相關(guān)研究較少。

本研究通過生存分析發(fā)現(xiàn)， 8個(gè)miRNA的表達(dá)與胃癌患者生存時(shí)間顯著相關(guān)。其中miR-139， miR-323b， miR-365a及miR-551b高表達(dá)預(yù)示患者生存時(shí)間較短;miR-17， miR-877，?miR-944， miR-7705， 高表達(dá)者預(yù)后較好。研究表明， 以上miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)。Pan等[8]發(fā)現(xiàn)， miR-944可調(diào)控MACC1/Met/AKT信號(hào)通路阻止EMT的形成， 從而抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)， miR-139可調(diào)控靶基因JUN表達(dá)， 參與胃癌發(fā)生發(fā)展。Wei等[10]發(fā)現(xiàn)miR-551b在卵巢癌干細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)， 抑制抑癌基因Foxo3和TRIM31的表達(dá)。而有研究則發(fā)現(xiàn)miR-551b在胃癌中呈低表達(dá)， 抑制胃癌細(xì)胞增值和侵襲， 認(rèn)為可能是通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬性凋亡[11]。郭水龍等[12]證實(shí)， miR-365可通過調(diào)控靶基因E2F2表達(dá)參與胃癌發(fā)生。另外相比正常組織， miR-17胃癌中呈高表達(dá)， 與胃癌大小、Lauren分型、pTNM分期相關(guān)[13]。此外研究表明， miR-323b高表達(dá)可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移導(dǎo)致不良預(yù)后[14]。劉寒梢等[15]通過miRNA表達(dá)譜芯片研究發(fā)現(xiàn)miR-877可作為結(jié)直腸癌篩查和早期診斷的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)， miR-7705與膀胱癌發(fā)生相關(guān)[16]。以上研究均未涉及miR-944， miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17差異表達(dá)與胃癌預(yù)后相關(guān)性。同時(shí)miR-323b， miR-877， miR-7705與胃癌相關(guān)性亦未見報(bào)道。本研究結(jié)果表明miR-944，?miR-139， miR-551b， miR-365， miR-17與胃癌患者生存顯著相關(guān)， 可作為預(yù)后相關(guān)因子;miR-323b， miR-877及miR-7705與胃癌發(fā)生、預(yù)后緊密相關(guān)， 可能在胃癌早期診治及預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面發(fā)揮重要作用。

此外， KEGG信號(hào)通路及GO功能分析結(jié)果表明， miRNA靶基因主要富集在腫瘤相關(guān)通路及功能上。故認(rèn)為miRNA可能通過調(diào)控其靶基因表達(dá)水平， 間接調(diào)控或參與以上腫瘤相關(guān)通路和功能， 在胃癌中發(fā)揮重要的作用。通過腫瘤基因數(shù)據(jù)庫（allOnco）發(fā)現(xiàn)， E2F1， CDKN1A等靶基因表達(dá)與胃癌確切相關(guān)。另外， ABCA1， TXNIP， KIF23等靶基因與胃癌患者總生存率顯著相關(guān)。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中大樣本的胃癌芯片及臨床數(shù)據(jù)， 采用可靠的生物信息學(xué)方法， 識(shí)別多個(gè)與胃癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)的miRNA及其靶mRNA， 為胃癌的診斷、治療及預(yù)后提供新的潛在的生物標(biāo)志物。

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[收稿日期：2018-12-11]