李宏亮 孫璇 龔蕓蕓 成嘉祁 劉暢 劉明珠 王生存 劉春 王慶華 邵義祥

(南通大學(xué) 1杏林學(xué)院，江蘇 南通 226001；2醫(yī)學(xué)院；3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以對(duì)稱性滑膜慢性炎癥、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞為特征的一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病〔1〕。臨床表現(xiàn)為多關(guān)節(jié)炎，主要累及手、腕、足等小關(guān)節(jié)，常反復(fù)發(fā)作，對(duì)稱分布，遷延難愈，此外還有發(fā)熱、疲乏等全身表現(xiàn)〔2〕。主要以關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、血管翳形成、炎性細(xì)胞浸潤、軟骨及軟骨下骨破壞為病理變化，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形強(qiáng)直，功能障礙〔3〕。本病的病因尚未完全闡明，多認(rèn)為與感染、遺傳、環(huán)境、性激素水平及營養(yǎng)不良、外傷、勞累、神經(jīng)精神狀態(tài)有關(guān)〔4,5〕。目前國內(nèi)外對(duì)RA的治療主要采取藥物治療、外科治療和心理康復(fù)治療。藥物治療主要以非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和植物制劑為主〔6〕，但效果不甚明顯，其發(fā)病率和致殘率仍居高不下。目前RA治療的最終目標(biāo)是防止和控制關(guān)節(jié)損壞，阻止功能喪失。近年來干細(xì)胞技術(shù)在世界范圍內(nèi)被廣泛成熟應(yīng)用，脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞〔7〕。具有廣泛增殖和分化成多個(gè)細(xì)胞系的能力〔8〕，主要功能為組織細(xì)胞修復(fù)，促進(jìn)細(xì)胞再生及免疫調(diào)控〔9,10〕。ADSCs因其諸多的優(yōu)勢(shì)功能及來源廣泛、取材方便、不易衰老、排斥反應(yīng)低等特點(diǎn)被大量的應(yīng)用于臨床治療，成為骨組織工程研究的熱點(diǎn)〔11,12〕。研究發(fā)現(xiàn)其具有抑制效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力〔13〕。但目前尚未見其用于治療RA的報(bào)道。本研究旨在探討ADSCs在RA治療中的抗炎作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 雞Ⅱ型膠原(CⅡ)購自Sigma公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol購自南京諾維贊生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購自索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司；引物由南京思普金生物科技有限公司合成。小鼠ADSCs由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性SPF級(jí)C5BL/6J小鼠30只，8周齡，23～27 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001〕。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室〔SYXK(蘇)：2015-0016〕，5只/籠，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗周期光照，溫度22～25℃，自由采食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及取材操作規(guī)程獲得南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3RA模型的誘導(dǎo) CⅡ以2 mg/ml的濃度溶解于0.1 mol/L pH3.2的乙酸中，置于4℃冰箱中過夜充分溶解。次日用等體積的完全弗氏佐劑(CFA)混合乳化，隨后每只老鼠以100 μl劑量尾部皮下均勻注射4～6個(gè)點(diǎn)。注射日計(jì)作0 d，其后每日觀察小鼠關(guān)節(jié)炎癥情況。第7天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射100 μl的CⅡ/CFA乳劑；第14天再次加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔與尾部皮下各注射100 μl的CⅡ/CFA乳劑，皮下多點(diǎn)注射，最終存活個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。隨機(jī)抽取3只小鼠進(jìn)行X線平片(X-Ray)檢測(cè)，并結(jié)合小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分確定造模是否成功。

1.4ADSCs治療及取材 ADSCs采用膠原酶裂解法獲得，用標(biāo)準(zhǔn)高糖混合F12培養(yǎng)基(DMEM-F12)進(jìn)行擴(kuò)增。第3代ADSCs被用于RA模型的治療，治療前檢測(cè)微生物和內(nèi)毒素。當(dāng)小鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分>2分，并確認(rèn)造模成功后進(jìn)行干細(xì)胞治療，治療組小鼠尾靜脈注射含有2×106個(gè)ADSCs的DMEM-F12培養(yǎng)液200 μl，對(duì)照組小鼠注射等量DMEM-F12，并計(jì)作0 d。在7 d、14 d再次進(jìn)行治療。小鼠雙后足踝關(guān)節(jié)注射CⅡ/CFA乳劑誘導(dǎo)炎癥發(fā)生5 d后，用便攜式測(cè)厚儀測(cè)量各組小鼠雙側(cè)踝關(guān)節(jié)直徑，并根據(jù)其腫脹程度進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分，每隔2天檢測(cè)1次，至第35天。小鼠踝關(guān)節(jié)的病變程度按5級(jí)評(píng)分法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)無紅腫計(jì)0分；踝關(guān)節(jié)輕度紅腫，不累及足趾計(jì)1分；踝關(guān)節(jié)輕度紅腫，累及足趾計(jì)2分；踝關(guān)節(jié)中度紅腫，并伴有組織腫脹計(jì)3分；踝關(guān)節(jié)重度紅腫，并出現(xiàn)功能障礙計(jì)4分。開始治療后30 d，動(dòng)物麻醉后心臟采血，取膝關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織置于4%多聚甲醛溶液(PFA)中固定，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5病理學(xué)切片制作及分析 膝關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織在PFA中充分固定后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1 h，重復(fù)1次，接著10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脫鈣處理4 w，隨后經(jīng)30%、50%、70%、80、90%乙醇溶液各1 h，無水乙醇1 h，重復(fù)1次，二甲苯透明30 min，重復(fù)1次，透蠟2 h，重復(fù)1次，包埋，徠卡石蠟切片機(jī)行5 μm切片，常規(guī)脫蠟復(fù)水后進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片后鏡檢并拍照存儲(chǔ)。

1.6RNA提取及qRT-PCR分析 膝關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織經(jīng)液氮處理后存放于-80℃冰箱，檢測(cè)時(shí)取出加入1 ml總RNA提取試劑(Trizol)后冰浴勻漿，在室溫下靜置5 min后于4℃下12 000 r/min離心15 min，上清液用異丙醇沉淀RNA，再次離心10 min，75%乙醇洗滌，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解并測(cè)定濃度。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并利用SYBR熒光體系在ABI7300上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算2-ΔΔCt值，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列：IL-10：正向：5′-CAGAGTCTAGGATGGGTTCATTAC-3′,反向：5′-TCCCAGCTGCACTTCATTT-3′;IL-6:正向：5′-GTCAACTCCATCTGCCCTTC-3′,反向：5′-TGTGGGTGGTATCCTCTGTG-3′;IL-1β:正向：5′-GA AGAAGAGCCCATCCTCTG-3′,反向：5′-TCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3′;TNF-α:正向：5′-CCAAAGGGATGAGAAGTTCC-3′,反向：5′-CTCCACTTGGTGGTTTGCTA-3;GAPDH:正向：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) IL-1β、IL-10及TNF-α按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.8統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1小鼠關(guān)節(jié)直徑及腫脹程度測(cè)定 模型組小鼠的評(píng)分始終維持在4分水平，而干細(xì)胞組小鼠的評(píng)分在用藥后第20天基本達(dá)到2分甚至1分，說明其腫脹程度被明顯抑制。

2.2兩組關(guān)節(jié)水腫情況 從外觀上發(fā)現(xiàn)模型組小鼠雙足踝關(guān)節(jié)有明顯的腫脹，皮膚顏色較深，伴有運(yùn)動(dòng)功能障礙，甚至出現(xiàn)跛行。相較于模型組，干細(xì)胞組關(guān)節(jié)腫脹程度明顯被抑制(圖1)。

2.3兩組關(guān)節(jié)病理情況 經(jīng)HE染色，模型組踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)典型的炎癥表現(xiàn)，如軟骨損傷，滑膜增生，大量的炎性細(xì)胞浸潤。而干細(xì)胞組關(guān)節(jié)病理變化得到顯著改善，軟骨損傷及滑膜增生減輕，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(圖2)。

圖1 兩組小鼠關(guān)節(jié)水腫情況

圖2 兩組關(guān)節(jié)病理情況(HE染色)

2.4兩組關(guān)節(jié)炎癥因子表達(dá)情況 干細(xì)胞組治療后關(guān)節(jié)組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平極顯著下降(P<0.001)。而IL-10的表達(dá)量則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，干細(xì)胞組治療后其表達(dá)量極顯著升高(P<0.001)。干細(xì)胞組血清中TNF-α，IL-1β呈極顯著降低，IL-10呈極顯著增加(P<0.001)，見表1。

表1 兩組炎癥因子表達(dá)情況

與模型組比較：1)P<0.001

3 討 論

采用雞膠原法誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型能夠較好地模擬人類RA的臨床表現(xiàn)，是篩選和研究治療RA藥物的良好模型。多種炎癥因子參與RA疾病的發(fā)生及發(fā)展，TNF-α及其受體、IL發(fā)揮著不可忽視的作用〔14〕。IL-6是骨吸收的主要調(diào)節(jié)者，低濃度IL-6刺激破骨細(xì)胞形成，較高濃度則能刺激成熟的破骨細(xì)胞骨吸收功能。在RA發(fā)生過程中，成骨細(xì)胞在外界刺激下產(chǎn)生IL-6，IL-6與受體復(fù)合物及膜受體糖蛋白130結(jié)合，啟動(dòng)下游多種轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)單核細(xì)胞融合，刺激多核破骨細(xì)胞的分化成熟，促進(jìn)急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的表達(dá)與分泌，最終導(dǎo)致炎癥細(xì)胞過度增殖和自身免疫性損傷〔15,16〕。

ADSCs能直接或間接作用于T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，從而抑制IL-1β，TNF-α，干擾素(IFN)-γ，IL-6等炎癥因子的表達(dá)，誘導(dǎo)IL-10等抗炎因子的產(chǎn)生〔17〕。

本研究ADSCs顯著抑制了RA小鼠關(guān)節(jié)局部TNF-α、IL-1β、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)顯著提高了IL-10的轉(zhuǎn)錄水平與表達(dá)。證明ADSCs對(duì)RA小鼠具有良好的治療作用，其作用機(jī)制及靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。