劉喜婷 楊磊 馬琴 顧峰 吳玉強(qiáng)

(甘肅省腫瘤醫(yī)院呼吸腫瘤內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050)

蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(CIP2A)是一種從人胎腦cDNA文庫中克隆出來的基因，其在腫瘤組織中高表達(dá)，是一種潛在的癌基因〔1〕。研究顯示，CIP2A不僅可以促進(jìn)正常的胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)生癌變，還能夠直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)具有自我更新能力的前體細(xì)胞生長(zhǎng)，幫助癌細(xì)胞躲避治療引起的細(xì)胞老化和衰老〔2,3〕。目前在胃癌、肺癌、結(jié)腸癌等組織中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CIP2A高表達(dá)，并且沉默其表達(dá)可以誘導(dǎo)胃癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡，而其在肺癌細(xì)胞凋亡中的作用尚不明確〔4～6〕。研究表明，CIP2A能夠穩(wěn)定致癌因子c-myc的表達(dá)，而c-myc是Wnt信號(hào)通路的靶基因，CIP2A可能與Wnt信號(hào)通路調(diào)控作用有關(guān)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)通過沉默肺癌細(xì)胞中CIP2A的表達(dá)，探討沉默CIP2A在肺癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299購自上海博谷生物科技有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-9抗體購自美國Cell Signaling Technology；CIP2A引物和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海生工合成；CIP2A shRNA慢病毒和shRNA陰性對(duì)照慢病毒由北京合生基因科技有限公司構(gòu)建；CIP2A抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；RPMI1640、胎牛血清購自美國Gibco；Cleaved Caspase-3抗體購自美國ABCAM；β-catenin抗體、c-myc抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購自大連寶生物。

1.2慢病毒感染及沉默效果檢測(cè) 取H1299細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)，細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至40%以后，在每個(gè)孔內(nèi)加入適量的病毒液，同時(shí)添加1 ml的RPMI1640，病毒感染復(fù)數(shù)為20，在每個(gè)孔中加入1.5 μl的聚凝胺polyberne(8 g/L)，混合后，置于飽和濕度、5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)箱中孵育1 d后，更換成1.5 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)加入1.5 μl的1 mg/ml嘌呤霉素puromycin進(jìn)行篩選，每隔2 d進(jìn)行換液，篩選7 d后，用Realtime PCR和Western印跡檢測(cè)沉默效果。將穩(wěn)定感染靶向CIP2A shRNA的慢病毒細(xì)胞記為CIP2A shRNA組，同時(shí)把感染shRNA陰性對(duì)照慢病毒的細(xì)胞記為shRNA-NC組，以不添加病毒的細(xì)胞記為Control組。

Realtime PCR檢測(cè)沉默效果：取各組細(xì)胞，用TRIZOL方法提取細(xì)胞中的RNA，步驟同試劑盒，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以SYBR Green進(jìn)行Realtime PCR，步驟均同試劑盒。CIP2A正義鏈5′-GATAGACTGATTGCTCAGCATCGC-3′，反義鏈5′-ACATACTAGCAAGTGTCCGTGCCTC-3′。GAPDH正義鏈5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，反義鏈5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

Western印跡檢測(cè)沉默效果：取各組細(xì)胞，在細(xì)胞中添加苯甲基磺酰氟(PMSF)/RIPA蛋白裂解液，充分吹打混合裂解以后，4℃環(huán)境離心。取蛋白上清，用二喹啉甲酸(BCA)法定量，保存在-80℃。配制10%分離膠、5%濃縮膠，在每個(gè)孔內(nèi)加入20 μg的蛋白，首先將電壓設(shè)置為80 V，電泳約60 min后，蛋白處于濃縮膠和分離膠的交界處，此時(shí)蛋白形成一條直線，再把電壓升高到150 V，直至染料到凝膠的底部以后，關(guān)閉電源。將凝膠取出，進(jìn)行濕轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜裝置置于冰上，轉(zhuǎn)膜的電壓為100 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)為70 min。把磷酸纖維素(NC)膜放在封閉液(300 mg脫脂奶粉溶解在10 ml的TBST)中，室溫孵育1 h。配制含有1∶100 CIP2A抗體的孵育液，將NC膜置于其中，置于4℃中過夜反應(yīng)。配制1∶5 000的二抗稀釋液，與NC膜在室溫中結(jié)合2 h后，以電化學(xué)發(fā)光(ECL)方法顯色，采集圖像，分析條帶的灰度值，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，分析各組CIP2A蛋白水平。

1.3沉默CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的影響 取各組細(xì)胞，以Western印跡方法檢測(cè)細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路蛋白β-catenin、c-myc的表達(dá)水平，檢測(cè)沉默CIP2A對(duì)Wnt信號(hào)通路激活水平影響，步驟同1.2。 用18 mmol/L的Wnt/β-catenin通路激活劑氯化鋰(LiCl)處理沉默CIP2A后的肺癌細(xì)胞記為CIP2A shRNA+LiCl組。

1.4細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 以噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶能夠與MTT結(jié)合形成藍(lán)色結(jié)晶，死細(xì)胞不能產(chǎn)生結(jié)晶，用二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶，檢測(cè)570 nm的OD值，OD值與活細(xì)胞數(shù)目呈正比。步驟如下：取H1299細(xì)胞，接種到96孔板，每個(gè)孔中加入4 000個(gè)細(xì)胞，按照Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl分組處理以后，置于培養(yǎng)箱中孵育4 d，期間每1 d取出培養(yǎng)板進(jìn)行MTT檢測(cè)，在細(xì)胞中添加MTT溶液，孵育4 h顯色，把孔內(nèi)的液體吸棄以后，加入150 μl的DMSO終止反應(yīng)，以570 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)OD值。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 以膜聯(lián)蛋白(Annexin)-V FITC和碘化丙啶(PI)雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡。具體步驟如下：Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl按照上述方法分組處理以后，培養(yǎng)2 d。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗滌3次，加入100 μl的結(jié)合緩沖液、5 μl的 Annexin V-FITC、10 μl的PI混合后，置于室溫避光反應(yīng)15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡變化。

1.6Wnt信號(hào)通路激活劑對(duì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平影響 Control、shRNA-NC、CIP2A shRNA、CIP2A shRNA+LiCl細(xì)胞按照上述方法處理培養(yǎng)2 d以后，以Western印跡法測(cè)定細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平，步驟同1.2。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1沉默CIP2A效果檢測(cè)結(jié)果 與Control組比較，CIP2A shRNA組CIP2A mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)，shRNA-NC組CIP2A mRNA和蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)CIP2A在各組肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

組別CIP2A mRNACIP2A 蛋白Control組1.00±0.000.78±0.09shRNA-NC組0.98±0.080.79±0.07CIP2A shRNA組0.35±0.051)0.24±0.061)

與Control組比較:1)P<0.05；表2同

2.2沉默CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路激活水平影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組β-catenin、c-myc表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 Western印跡測(cè)定β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)

組別β-cateninc-mycControl組0.58±0.060.47±0.05shRNA-NC組0.56±0.090.48±0.08CIP2A shRNA組0.23±0.021)0.16±0.031)

2.3激活Wnt信號(hào)通路對(duì)沉默CIP2A誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞增殖抑制作用影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)；與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組肺癌細(xì)胞增殖情況及凋亡率比較

與Control組比較:1)P<0.05；與CIP2A shRNA組比較:2)P<0.05；表4同

2.4激活Wnt信號(hào)通路對(duì)沉默CIP2A誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定肺癌細(xì)胞凋亡率

2.5Wnt信號(hào)通路激活劑對(duì)沉默CIP2A的肺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平影響 與Control組比較，CIP2A shRNA組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與CIP2A shRNA組比較，CIP2A shRNA+LiCl組β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Caspase-3、Caspase-9活化水平顯著降低(P<0.05)。見表4和圖4。

表4 各組β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平比較

1～4：Control組、shRNA-NC組、CIP2A shRNA組、CIP2A shRNA+LiCl組圖4 Western印跡測(cè)定β-catenin、c-myc、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

3 討 論

編碼CIP2A蛋白的基因定位于3q13.13染色體上，其DNA的長(zhǎng)度為38.8 kb，含有21個(gè)外顯子，編碼的蛋白由905個(gè)氨基酸組成〔8〕。CIP2A主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，核酸序列分析顯示，其mRNA的5′端含有較多的GC堿基，在其3′端含有AATAAA多聚腺苷磷酸化信號(hào)和ATTTA序列，參與維持mRNA的穩(wěn)定，CIP2A蛋白的羧基端含有1個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和2個(gè)磷酸化位點(diǎn)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中含有2個(gè)5肽結(jié)構(gòu)，其氨基酸含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和Armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)，CIP2A蛋白這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其參與腫瘤發(fā)生具有密切關(guān)系〔9～12〕。CIP2A在腦組織、前列腺組織等良性組織中高度表達(dá)，在胃、肺等組織中表達(dá)水平較低〔13〕。目前的研究表明，CIP2A在腫瘤中高表達(dá)，其可以通過與c-myc等結(jié)合影響腫瘤的發(fā)生，下調(diào)其表達(dá)后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，另外，CIP2A還具有促進(jìn)正常細(xì)胞癌化的作用〔14,15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CIP2A沉默能夠在體外抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，CIP2A在肺癌細(xì)胞中可能發(fā)揮癌基因的作用。

Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9是細(xì)胞凋亡發(fā)生的促進(jìn)因子，二者在Caspase凋亡反應(yīng)中發(fā)揮凋亡執(zhí)行和起始的作用，正常情況下，其以沒有活性的Caspase-3、Caspase-9形式存在于細(xì)胞內(nèi)，只有被活化后才可以發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默CIP2A后的肺癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白水平升高，提示沉默CIP2A促進(jìn)Caspase介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡。

c-myc是目前公認(rèn)的癌基因，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等作用，受到細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)及基因的調(diào)控作用〔18～20〕。c-myc是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因，其表達(dá)水平的高低可以間接反映Wnt信號(hào)通路的激活水平〔21,22〕。目前對(duì)于CIP2A調(diào)控腫瘤的作用機(jī)制研究尚不明確，研究顯示，CIP2A可以直接同c-myc的氨基端結(jié)合，抑制抑癌因子PP2A的表達(dá)，而PP2A的活性升高可以通過抑制β-catenin復(fù)合物的降解阻礙β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，引起Wnt信號(hào)通路激活受阻，CIP2A可能具有調(diào)控Wnt信號(hào)通路激活的作用〔23～25〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默CIP2A后的肺癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路激活水平降低，并且Wnt信號(hào)通路激活劑可以逆轉(zhuǎn)沉默CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞增殖凋亡的影響，沉默CIP2A可以通過降低Wnt信號(hào)通路的激活水平誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。CIP2A影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡的機(jī)制較為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)初步探討了沉默CIP2A對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡的影響與Wnt信號(hào)通路有關(guān)，二者是通過何種調(diào)控及結(jié)合方式尚未研究。

綜上，沉默CIP2A可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制肺癌細(xì)胞增殖活性，其作用機(jī)制與下調(diào)Wnt信號(hào)通路激活水平有關(guān)，對(duì)于其是如何靶向調(diào)控Wnt信號(hào)通路機(jī)制尚未探討。本實(shí)驗(yàn)明確了CIP2A在肺癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用，為靶向CIP2A治療肺癌提供了新思路，為明確CIP2A在肺癌發(fā)生中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。