過一清 鄭華 蔣子龍

(1甘肅省第二人民醫(yī)院普外科,甘肅 蘭州 730000；2蘭州市婦幼保健院超聲科)

乳腺癌靶向基因治療成為研究熱點〔1〕。性別決定區(qū)Y框蛋白(SOX)4是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其在人類胚胎發(fā)育的周圍神經(jīng)組織、脾臟、毛囊等組織中廣泛表達，在成年人的卵巢、胸腺、乳腺等組織的特定細胞中表達，SOX4參與骨骼、胰島、心臟等發(fā)育過程，與骨質(zhì)疏松、腫瘤等疾病的發(fā)生有關(guān)〔2～4〕。研究顯示，SOX4在子宮內(nèi)膜癌、膽囊癌、前列腺癌等腫瘤組織中高表達，沉默SOX4可以抑制黑色素瘤等腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和生長，SOX4在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮促進作用〔2，5～7〕。SOX4在乳腺癌組織中有較高水平的表達，并且其表達水平的高低與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)〔8〕。本研究探討敲減SOX4對乳腺癌細胞生長、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌MCF-7細胞購自美國ATCC，細胞培養(yǎng)參數(shù)為：飽和濕度，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。兔抗細胞周期蛋白(Cyclin)D1一抗、兔抗p21一抗購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；SOX4 siRNA重組慢病毒、陰性對照重組慢病毒均由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建包裝；TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司；PCR所用試劑購自大連TaRaka公司；兔抗波形蛋白(Vimentin)一抗、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2一抗購自天津賽爾生物技術(shù)有限公司；PI單染細胞周期檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；兔抗上皮性鈣黏附素(E-cadherin)一抗、兔抗MMP-9一抗購自美國Proteintech Group；兔抗SOX4一抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2SOX4 siRNA對乳腺癌細胞中SOX4表達影響

1.2.1分組及培養(yǎng) MCF-7細胞分成3組，把感染SOX4 siRNA重組慢病毒的MCF-7細胞記為Lv-si-SOX4組；把感染陰性對照重組慢病毒的MCF-7細胞記為Lv-NC組；把沒有感染重組慢病毒的MCF-7細胞記為Control組。慢病毒感染方法如下：在生長密度為30%～40%的MCF-7細胞中添加慢病毒液，慢病毒感染復數(shù)為20，慢病毒感染1 d以后將原病毒液吸棄，添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，感染效率高于85%可用于后續(xù)實驗。

1.2.2qRT-PCR 在3組細胞中添加TRIZOL裂解液，按照TRIZOL試劑說明書提取各組乳腺癌細胞總RNA。分別取RNA，紫外分光光度計法檢測A260 nm/A280 nm在1.8～2.0。用cDNA合成試劑盒，在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄體系，包括：2 μl 10×RT緩沖液、2 μl脫氧核糖核酸(dNTP)混合物、2 μl寡脫氧核苷酸(Oligo-dT)、1 μl反轉(zhuǎn)錄酶、2 μl RNA，最后加去離子水至20 μl，反應條件設置為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃，10 min。引物如下：β-actin正義鏈5′-CACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′，反義鏈5′-ATAGAGCCACCAATCCACACACAG-3′；SOX4正義鏈5′-CTTGACATGATTAGCTGGCATGATT-3′，反義鏈5′-CCTGTGCAATATGCCGTGTAGA-3′。cDNA作為模板，進行PCR，反應體系包括：25 μl SYBR GreenⅠ、0.5 μl上游引物、0.5 μl下游引物、23.5 μl無RNA酶的水、0.5 μl cDNA模板，加去離子水至50 μl，PCR條件為：95℃，60 s；95℃，15 s；58℃，30 s；72℃ 30 s，共循環(huán)40次。根據(jù)ABI7300 PCR程序得到每個反應的Ct值，把β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct法計算不同組乳腺癌細胞中SOX4表達水平。

1.2.3Western印跡法 在3組細胞中添加含有1 mmol/L苯甲基磺酞氟(PMSF)的RIPA的裂解液，放在冰上反應30 min以后，在4℃低溫離心，吸取上清在-80℃保存。以二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量分析以后，配制十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，凝膠使用10%的分離膠和5%的上層膠。把蛋白樣品與1倍體積的2×結(jié)合緩沖液混合以后，置于100℃水浴中反應5 min。按照每孔內(nèi)添加30 μg蛋白樣品計算，80 V電泳40 min以后，120 V電泳直至染料進入到凝膠的底部。用半干式電轉(zhuǎn)膜方法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜電流為150 mA。免疫反應：取電轉(zhuǎn)以后的PVDF膜放在5%脫脂奶粉封閉液中孵育1 h，置于TBST中洗膜3次，再放在1∶800稀釋的SOX4一抗反應液中室溫結(jié)合2 h，同樣用TBST洗膜3次，與1∶2 000稀釋的二抗反應后，TBST洗膜3次。按照電化學發(fā)光(ECL)試劑盒發(fā)光以后，測定各組SOX4和β-actin條帶的灰度值，β-actin為內(nèi)參，計算分析SOX4蛋白水平。

1.3噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖 3組細胞密度調(diào)整為5×107個細胞/L，接種到96孔板中，每個孔內(nèi)添加100 μl的細胞懸液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將邊緣的各孔填充。分別在細胞培養(yǎng)至1 d、2 d、3 d、4 d時取出細胞培養(yǎng)板，在每個孔內(nèi)添加0.5%的MTT溶液(每孔中添加20 μl)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h以后，將孔內(nèi)的液體小心吸除，添加150 μl的二甲基亞砜溶液，放在搖床上震蕩結(jié)合10 min后，使結(jié)晶物充分溶解，將培養(yǎng)板置于酶標儀上測定570 nm波長處的A值。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期 3組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化以后，配制成單細胞懸浮液，以1 200 r/min離心10 min以后，加入PBS將細胞中血清去除。在細胞中添加70%的乙醇溶液固定后，保存在4℃。加入10 mg/L的碘化丙啶(PI)染液孵育5 min后，放在4℃避光反應30 min，用流式細胞儀檢測周期變化。

1.5Transwell小室檢測細胞侵襲和遷移 侵襲實驗步驟為：用50 mg/L的基質(zhì)膠按照1∶8的比例稀釋以后，包被Transwell小室，放在4℃風干以后，置于37℃過夜；用不含血清的細胞培養(yǎng)液將3組細胞稀釋以后(此時細胞密度為1×105個/ml)，吸取200 μl的細胞懸浮液接種到Transwell小室的上室中，在小室的下室中添加含有胎牛血清的細胞培養(yǎng)液500 μl，培養(yǎng)24 h以后，多聚甲醛固定，以結(jié)晶紫染色以后，選取5個視野，計數(shù)侵襲細胞數(shù)目。遷移實驗前不用基質(zhì)膠包被Transwell小室，其余步驟同侵襲實驗。

1.6Western印跡檢測細胞中CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin蛋白表達 取3組細胞，用Western印跡方法檢測各組乳腺癌細胞中CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9、Vimentin、E-cadherin蛋白水平，Western印跡步驟同1.2.3。

1.7統(tǒng)計學分析 應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1SOX4 siRNA對乳腺癌細胞中SOX4表達影響 Lv-si-SOX4組SOX4 mRNA和蛋白水平均顯著低于Lv-NC組及Control組(均P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測SOX4蛋白表達

組別SOX4 mRNASOX4蛋白Control組1.00±0.000.48±0.06Lv-NC組1.02±0.120.51±0.07Lv-si-SOX4組0.19±0.031)2)0.14±0.021)2)

與Lv-NC組比較：1)P<0.05；與Control組比較：2)P<0.05；下表同

2.2敲減SOX4對乳腺癌細胞增殖影響 Lv-si-SOX4細胞A570值明顯低于Control組和Lv-NC組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞A570值比較

2.3敲減SOX4對乳腺癌細胞周期分布影響 與Control組及Lv-NC組比較，Lv-Si-SOX4組乳腺癌細胞G0/G1比例明顯升高，S期及G2/M期細胞比例明顯降低，細胞周期促進因子CyclinD1蛋白表達顯著下降，細胞周期抑制因子p21蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 Western印跡檢測CyclinD1、p21蛋白表達

表3 各組乳腺癌細胞周期分布、細胞侵襲、遷移能力及CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達比較

2.4敲減SOX4對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力影響 與Control組及Lv-NC組比較，Lv-si-SOX4組細胞侵襲和遷移數(shù)目均顯著降低，細胞中MMP-2、MMP-9蛋白水平也顯著降低(均P<0.05)，見表3、圖3。

圖3 Western印跡檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達

2.5敲減SOX4對乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)影響 與Control組及Lv-NC組比較，Lv-si-SOX4組上皮標志物E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，間質(zhì)標志物Vimentin蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見表4和圖4。

圖4 Western印跡檢測Vimentin、E-cadherin蛋白表達

組別VimentinE-cadherinControl組0.87±0.070.29±0.04Lv-NC組0.90±0.110.30±0.03Lv-si-SOX4組0.25±0.061)2)0.42±0.051)2)

3 討 論

SOX4基因是一種單外顯子基因，其編碼的蛋白質(zhì)由474個氨基酸組成，SOX4蛋白的C端含有一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，N端含有一個高遷移率族蛋白(HMG)結(jié)構(gòu)域，HMG結(jié)構(gòu)域能特異性地結(jié)合呈直線的DNA雙螺旋小溝并促使其彎曲，從而影響染色體的結(jié)構(gòu)，促進轉(zhuǎn)錄增強子復合物功能發(fā)揮〔9，10〕。SOX4蛋白還含有一個甘氨酸富集區(qū)和絲氨酸富集區(qū)，能夠參與細胞凋亡反應，SOX4在心臟發(fā)育、前B細胞生長、胰島素分泌等過程中具有關(guān)鍵作用，SOX4是一個具有多種生物學功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子〔11，12〕。研究表明，SOX4可能具有促進腫瘤發(fā)展的作用，SOX4異常過表達可能是腫瘤患者預后差的標記基因，高表達SOX4的膀胱癌等腫瘤細胞更容易形成轉(zhuǎn)移灶，同樣在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)SOX4高表達〔13，14〕。SOX4過度高表達可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)〔15〕。

本實驗表明，敲減SOX4后的乳腺癌細胞的增殖能力降低，細胞周期被阻滯在G0/G1期，細胞的侵襲和遷移能力也下降，提示敲減SOX4具有抑制乳腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的作用。之前的研究報道表明，SOX4具有促進細胞增殖的作用，敲減SOX4后的黑色素瘤細胞G1期進入S期的比例減少，細胞增殖能力降低〔16〕。G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變是細胞周期中的關(guān)鍵調(diào)控點，其受到細胞內(nèi)CyclinD1、p21等周期相關(guān)蛋白的調(diào)控作用，CyclinD1具有促進細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的作用，p21具有阻礙細胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變的作用〔17，18〕。本實驗表明，敲減SOX4后的乳腺癌細胞中的CyclinD1蛋白表達水平降低，p21蛋白表達水平升高，敲減SOX4可以通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白的表達抑制細胞從G0/G1期向S期進展，從而發(fā)揮抑制乳腺癌細胞增殖的作用。

腫瘤細胞EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標志，在這一過程中，腫瘤細胞上皮特性逐漸消失，E-cadherin等上皮細胞標志物的表達降低，與此同時細胞逐漸表現(xiàn)出間質(zhì)細胞特性，間質(zhì)細胞標志物Vimentin表達水平升高〔19，20〕。腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞降解細胞外基質(zhì)有關(guān)，腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落以后，黏附于細胞外基質(zhì)上，并通過分泌細胞外基質(zhì)降解酶進入血管及淋巴管，形成新的并發(fā)灶〔21，22〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的成員，也是目前為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的細胞外基質(zhì)降解酶，二者表達水平升高標志腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生〔23〕。SOX4具有調(diào)控腫瘤細胞EMT的作用，在肺癌、食管癌等腫瘤細胞中研究均表明，沉默SOX4可以抑制腫瘤細胞EMT并下調(diào)腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力〔24，25〕。本實驗的結(jié)果顯示，敲減SOX4后的乳腺癌細胞侵襲和遷移能力降低，細胞EMT水平也下降，細胞合成的MMP-2和MMP-9減少，說明敲減SOX4具有抗乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的作用。

綜上，靶向SOX4可能是治療乳腺癌的有效途徑，敲減SOX4具有抑制乳腺癌細胞增殖，阻滯細胞周期，抑制細胞侵襲和遷移的能力，這為研究SOX4在惡性腫瘤發(fā)生中的作用機制奠定了基礎。本實驗只初步探討了敲減SOX4對乳腺癌細胞惡性表型的影響，對于其具體的作用機制尚未研究，在以后的實驗中會對其機制進行具體分析。