沈銀峰 巴元明 金文銀 張霞 陳乾 田軍軍 朱勇 陶然

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北省中醫(yī)院外四科，武漢 430072；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430072

重癥急性胰腺炎(SAP)是一種常見的臨床急腹癥，病程進(jìn)展快，病因復(fù)雜，預(yù)后不良，病死率高達(dá)10%～30%[1]。SAP時多種致病因素導(dǎo)致胰腺腺泡損傷，釋放多種被激活的胰酶及炎癥細(xì)胞因子，引起胰腺組織的炎癥性壞死[2]。此外，細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)通過血循環(huán)擴(kuò)展至全身，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)一步導(dǎo)致多器官功能衰竭[3]。Janus激酶(JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是大多數(shù)細(xì)胞存在的最主要的基本途徑，其中JAK2-STAT3途徑最為重要[4]。本研究通過抑制JAK2-STAT3信號途徑，探討SAP狀態(tài)下胰腺損傷與全身炎癥反應(yīng)的關(guān)系。

材料與方法

一、動物與試劑

雄性健康Wistar大鼠(體重210～250 g)購自湖北省實驗動物研究中心，實驗前在22℃、12 h晝夜循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)化飲食和自由飲水條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。?；悄懰徕c購自Sigma公司；JAK2抑制劑Ruxolitinib和STAT3抑制劑Stattic購自美國Selleck Chemicals；TNF-α和IL-4 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems；RT-qPCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific；cDNA合成試劑盒購自美國Bio-Rad Laboratories；引物和探針購自中國大連Takara Bio；JAK2、STAT3一抗和二抗購自南京KeyGen生物科技有限公司。

二、動物模型建立及分組

造模前大鼠禁食12 h，不禁水，采用逆行膽胰管注射5%?；悄懰徕c(1.0 ml/kg體重，0.1 ml/min)法制備急性壞死性胰腺炎(acute necrotic pancreatitis, ANP)模型[5]，術(shù)后大鼠自由飲水。按數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為ANP組、ANP+Ruxolitinib組(ANP+R組)、ANP+Stattic組(ANP+S組)、ANP+Ruxolitinib+Stattic組(ANP+R+S組)以及健康對照組(SO組)，每組48只。SO組大鼠逆行膽胰管注射等容積生理鹽水。Ruxolitinib術(shù)前2 h灌胃(180 mg/kg體重)，Stattic術(shù)前2 h腹腔注射(3.75 mg/kg體重)，其他組大鼠給予等容積生理鹽水灌胃或腹腔注射。

造模后3、6、12、18 h分批處死大鼠，腹主動脈取血，離心分離血清，于-70℃冰箱凍存。取胰腺組織，用PBS液沖洗干凈，快速液氮冷凍后于-70℃冰箱凍存。

三、血清淀粉酶(AMY)、TNF-α和IL-4含量檢測

AMY活性由自動生物化學(xué)檢測儀測定，TNF-α和IL-4水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測，按說明書操作。

四、胰腺組織JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)檢測

取凍存的胰腺組織，研磨成粉狀后采用Trizol提取組織總RNA，先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再行RT-qPCR測定JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平。JAK2引物上游序列5′-TTTGAAGACAGGGACCCTACACAG-3′，下游序列3′-TCATAGCGGCACATCTCCACA-5′；STAT3上游序列5′-CACCCATAGTGAGCCCTTGGA-3′，下游序列3′-TGAGTGCAGTGACCAGGACAGA-5′；GAPDH上游序列5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游序列3′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-5′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)。以公式2-△△Ct計算JAK2、STAT3 mRNA相對表達(dá)量。

五、胰腺組織磷酸化JAK2 (p-JAK2)和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白測定

將胰腺組織勻漿加入細(xì)胞裂解液裂解30 min，蛋白定量后取10 μg行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡法檢測p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。使用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件測定每個條帶的灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比代表蛋白質(zhì)相對表達(dá)量。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組血清AMY、TNF-α和IL-4水平變化

血清AMY、TNF-α和 IL-4水平分別在6、12、12 h時達(dá)峰值。ANP組、ANP+R組、ANP+S組、ANP+R+S組各時點(diǎn)AMY、TNF-α、IL-4水平均顯著高于SO組，ANP+R組、ANP+S組和ANP+R+S組又均顯著低于ANP組，ANP+R+S組顯著低于ANP+R組和ANP+S組，ANP+R組顯著低于ANP+S組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，表1)。

二、各組胰腺組織JAK2、STAT3 mRNA及p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)的變化

各組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白、STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均12 h達(dá)到峰值(圖1)。ANP組、ANP+R組、ANP+S組和ANP+R+S組各時點(diǎn)JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白、STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著高于SO組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 各組血清AMY、TNF-α和IL-4水平比較

注：與SO組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與ANP+R組比較，cP<0.05；與ANP+S組比較，dP<0.05

ANP+R組、ANP+R+S組JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)均顯著低于ANP組及ANP+S組，但ANP+S組與ANP組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

ANP+R組、ANP+S組、ANP+R+S組STAT3 mRNA和p-STAT3 蛋白表達(dá)均顯著低于ANP組，ANP+ S組、ANP+R+S組均顯著低于ANP+ R組，ANP+ R+S組又顯著低于ANP+S組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)

表2 各組胰腺組織JAK2 mRNA 、p-JAK2蛋白、STAT3 mRNA、p-STAT3蛋白表達(dá)變化

注：與SO組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05；與ANP+R組比較，cP<0.05；與APN+S組比較，dP<0.05

圖1 各組胰腺組織p-JAK2(上)、p-STAT3(下)蛋白表達(dá)

討 論

SAP發(fā)病之初胰腺腺泡內(nèi)的各種酶、血管舒緩素和緩激肽等均被激活，胰腺組織自身消化，發(fā)生出血、壞死，釋放花生四烯酸、氧自由基、補(bǔ)體、促炎癥因子和抗凝物質(zhì)等，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，引起炎癥爆發(fā)，進(jìn)而發(fā)生全身多器官功能不全，這是SAP患者早期死亡高峰的主要原因[6]。SAP時胰腺組織細(xì)胞受損，胰腺組織中儲留的單核巨噬細(xì)胞首先被激活，合成和釋放多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等[7]，進(jìn)而激活粒細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，繼而啟動炎癥反應(yīng)，過度炎癥反應(yīng)時則啟動抗炎反應(yīng)，產(chǎn)生IL-4、IL-10等抑炎因子[7-8]，因此SAP發(fā)生、發(fā)展過程中有多種抗炎和促炎細(xì)胞因子的參與。TNF-α和IL-4分別是體內(nèi)重要的促炎和抗炎細(xì)胞因子[9]。TNF-α是SAP病程演進(jìn)過程中較早出現(xiàn)、生物學(xué)效應(yīng)最為廣泛的細(xì)胞因子，與SAP全身并發(fā)癥的關(guān)系較為直接且肯定[10]。IL-4主要由Th-2細(xì)胞產(chǎn)生，具有潛在的抗炎功能，可抑制TNF-α等促炎細(xì)胞因子的合成與釋放，對SAP所致的多器官損傷具有改善作用[11]。本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠外周血TNF-α和IL-4明顯升高，變化最為迅速。

靶細(xì)胞中存在的蛋白酪氨酸激酶(PTK)介導(dǎo)細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后的信號蛋白分子級聯(lián)反應(yīng)。細(xì)胞因子與受體結(jié)合后發(fā)生酪氨酸磷酸化，激活JAK，進(jìn)而使STAT蛋白磷酸化，激活 STAT， 再誘導(dǎo)目的基因表達(dá)。JAK2-STAT3是JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑家族中最重要的途徑，參與許多細(xì)胞因子包括TNF-α和IL-6的免疫應(yīng)答[12-13]。研究表明，激活的JAK2-STAT3信號通路在急性胰腺炎中起關(guān)鍵作用[14]。Ruxolitinib是一種酪氨酸激酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于抑制JAK1、2，并被FDA批準(zhǔn)用于臨床[15]。Stattic是一種有效的活化STAT3的抑制劑，應(yīng)用于STAT3活化的細(xì)胞系或動物模型[16]。Ju等[17]報道，通過抑制JAK2-STAT3、MAPKs和轉(zhuǎn)化生長因子-β1在胰腺腺泡細(xì)胞的表達(dá)，可抑制NADPH氧化酶，有效地預(yù)防和治療胰腺炎。 Zhu等[18]發(fā)現(xiàn)JAK2-STAT3通路在SAP誘導(dǎo)的急性腎損傷的分子機(jī)制中起重要作用，抑制JAK2-STAT3通路可降低血漿中TNF-α和IL-6的水平。本研究結(jié)果顯示，ANP大鼠血清AMY和炎癥細(xì)胞因子明顯升高，胰腺組織JAK2、STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用JAK2抑制劑和STAT3抑制劑可明顯下調(diào)這些基因和蛋白的表達(dá)，且聯(lián)合應(yīng)用JAK2抑制劑和STAT3抑制劑的效果最顯著，表明SAP發(fā)生和發(fā)展過程中胰腺組織JAK2-STAT3信號通路活化可能是導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突