江舒曼 趙寒冰 賈林 李偉冬 黃耀星 嚴(yán)清青 鄧祺 何梓健 杜洪

1廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)消化內(nèi)科，廣州 510180；2廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院)病理科，廣州 510180

重癥急性胰腺炎(SAP)患者中有50%容易發(fā)生腹腔內(nèi)高壓(intra-abdominal pressure，IAH)[1]，國(guó)際腹腔間隔室綜合征協(xié)會(huì)(WSACS)定義IAH為持續(xù)或反復(fù)的病理性腹腔內(nèi)壓≥12 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)[2]。SAP并發(fā)IAH使患者腸道細(xì)菌易位及腹腔內(nèi)感染的機(jī)會(huì)增加[3]。多年來國(guó)內(nèi)外運(yùn)用連續(xù)血液凈化、p38/p53 MAPK抑制劑或者早期腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)等方法保護(hù)腸屏障功能并運(yùn)用兩種或多種抗生素對(duì)抗腸內(nèi)致病菌的大量繁殖，但對(duì)SAP繼發(fā)腸源性感染的預(yù)防及控制效果仍不理想。如何運(yùn)用益生菌治療各種腸道疾病已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。研究指出，酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽通過減少炎癥因子的釋放調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)并維持腸屏障功能的穩(wěn)定[5]。本研究構(gòu)建急性壞死性胰腺炎(ANP)并發(fā)IAH大鼠模型，觀察酪酸梭菌及丁酸鹽干預(yù)對(duì)其炎癥因子、腸屏障功能、腸道病理學(xué)改變及腸道菌群的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及建模方法

80只Sprague-Dawley(SD)SPF級(jí)雌性大鼠，體重(224±13)g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041。按數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A組)、ANP并發(fā)IAH組(B組)、ANP并發(fā)IAH加酪酸梭菌干預(yù)組(C組)及ANP并發(fā)IAH加丁酸鈉干預(yù)組(D組)，C、D組于造模前10 d分別給予酪酸梭菌1×109CFU/d、丁酸鈉100 mg·kg-1·d-1灌胃，A、B組灌入等容積生理鹽水。預(yù)處理后B、C、D組均采用經(jīng)胰膽管注射4.5%牛黃膽酸鈉溶液1 mg/kg體重的方法制備ANP模型[6]，A組僅翻動(dòng)胰腺、胃腸等器官后關(guān)腹。制模后24 h采用左下腹直接穿刺并連接壓力換能器測(cè)定大鼠腹腔內(nèi)壓[7]，腹腔內(nèi)壓≥12 mmHg確定為IAH。每組隨機(jī)抽取10只成功建模的大鼠腹腔動(dòng)脈血，并取回腸末段組織10 cm。

二、血液指標(biāo)檢測(cè)

血標(biāo)本經(jīng)3 000 r/min離心10 min。全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(奧林巴斯AU5400，日本)檢測(cè)血淀粉酶；免疫酶聯(lián)吸附法(ELISA)檢測(cè)TNF-α、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和D-乳酸水平；采用顯色基質(zhì)鱟試劑測(cè)定血漿細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)水平。嚴(yán)格按照說明書操作。

三、回腸組織病理學(xué)檢查及菌群測(cè)定

取4%多聚甲醛固定的回腸末段組織，經(jīng)脫水、透明、透蠟、包埋、切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色，由兩位病理科醫(yī)師盲法在光鏡下觀察組織的病理變化，并根據(jù)小腸病理Chiu′s標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行評(píng)分。

根據(jù)各細(xì)菌的16sDNA基因序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)回腸黏膜酪酸梭菌、乳酸桿菌、普拉梭菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌的細(xì)菌數(shù)量，以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值/0.1 g腸黏膜濕重表示。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組大鼠腹腔內(nèi)壓力比較

A、B、C、D組大鼠的腹腔內(nèi)壓力分別為(5.94±0.28)、(14.62±2.68)、(14.92±3.12)、(15.13±2.98)mmHg，B、C、D組均>12 mmHg，均顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，但B、C、D組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、各組大鼠血指標(biāo)水平的比較

B、C、D組大鼠血淀粉酶及TNF-a水平均顯著高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，B、C、D組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B、C、D組大鼠血DAO、D-乳酸、LPS水平也均顯著高于A組， 而C、D組的DAO、D-乳酸、LPS水平均顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但C、D組間DAO、LPS水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

三、各組大鼠回腸病理評(píng)分及菌群比較

A組大鼠腸黏膜絨毛完整，固有層無淤血；B組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)不完整，上皮絨毛水腫及局部脫落，固有層有炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血；C、D組大鼠腸黏膜病理改變介于A、B兩者之間(圖1)。A、B、C、D組大鼠回腸病理評(píng)分分別為(1.20±0.75)、(4.21±0.83)、(2.36±0.38)、(2.03±0.84)分，B、C、D組顯著高于A組，B組又顯著高于C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而C、D組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

B組回腸末段黏膜有益菌(酪酸梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、普拉梭菌)數(shù)量較A組顯著減少，而致病菌(腸球菌、大腸埃希菌)顯著增多；C、D組有益菌數(shù)量均顯著高于B組，而致病菌數(shù)量均顯著低于B組；D組酪酸梭菌及腸球菌含量均顯著低于C組。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2)。

討 論

SAP并發(fā)IAH或腹腔間隔室綜合征時(shí)由于腸道組織的缺血再灌注、炎癥因子釋放、菌群失調(diào)、腸細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺失等[9]可引發(fā)腸黏膜屏障功能障礙甚至腸功能衰竭，導(dǎo)致黏膜通透性增高和腸內(nèi)大量致病菌和內(nèi)毒素易位，形成膿毒血癥，同時(shí)又可促進(jìn)炎癥因子釋放，兩者相互影響，易出現(xiàn)多器官衰竭，增加患者的死亡率。近年來益生菌對(duì)各種腸道疾病的治療作用受到極大關(guān)注，Bongaerts和Severijnen[10]提出應(yīng)該在胰腺炎發(fā)病初期應(yīng)用大量有代謝活性的益生菌，才能起到調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，減少后期繼發(fā)感染，從而改善AP疾病病程。

表1 各組大鼠血指標(biāo)的變化

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

圖1 正常對(duì)照組(1A)、ANP并發(fā)IAH組(1B)、ANP并發(fā)IAH加酪酸梭菌干預(yù)組(1C)及ANP并發(fā)IAH加丁酸鈉干預(yù)組(1D)大鼠回腸末段黏膜病理變化(HE ×100)

組別只數(shù)酪酸梭菌雙歧桿菌乳酸桿菌普拉梭菌腸球菌大腸埃希菌A組806.04±0.116.86±0.254.82±0.105.81±0.053.68±0.064.21±0.12B組803.24±0.07a3.26±0.24a2.09±0.06a2.65±0.08a6.93±0.12a7.06±0.37aC組809.81±0.37ab4.68±0.17ab4.01±0.12ab4.35±0.06ab5.76±0.23ab5.91±0.34abD組805.73±1.23abc4.81±0.05ab3.94±0.17ab4.07±0.15ab4.82±0.06abc5.73±0.28ab

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

酪酸梭菌是腸道內(nèi)的厭氧菌，它與其代謝產(chǎn)物丁酸鹽可以調(diào)節(jié)腸道免疫及微生態(tài)，抑制炎癥通路的激活，從而減少炎癥因子的釋放，維持腸屏障的穩(wěn)定[11-12]。本研究結(jié)果顯示，酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后大鼠血LPS、DAO及D-乳酸水平及回腸黏膜病理評(píng)分均較未干預(yù)大鼠顯著降低，說明酪酸梭菌及丁酸鹽可以在一定程度上維護(hù)腸黏膜屏障，降低腸黏膜及血管內(nèi)皮的通透性。

腸道細(xì)菌在人體里主要存在遠(yuǎn)端小腸和結(jié)腸內(nèi)，深層緊貼黏膜的由有益菌組成的共生菌形成細(xì)菌生物膜可防止致病菌與腸道上皮接觸，對(duì)維護(hù)腸道正常的生物屏障起重要作用。SAP并發(fā)IAH時(shí)腸道缺血再灌注損傷、麻痹性腸梗阻、腸壁水腫等導(dǎo)致腸內(nèi)致病菌大量繁殖。本研究結(jié)果顯示，酪酸梭菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、普拉梭菌等益生菌在未干預(yù)組的數(shù)量明顯低于正常對(duì)照組，而大腸桿菌、腸球菌等致病菌的數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組，提示在SAP并發(fā)IAH時(shí)確實(shí)存在嚴(yán)重腸道菌群失調(diào)。酪酸梭菌或丁酸鹽干預(yù)后4種有益菌數(shù)量均顯著高于未干預(yù)組，兩種致病菌數(shù)量均顯著低于未干預(yù)組，提示酪酸梭菌及丁酸鹽可以促進(jìn)益生菌生長(zhǎng)，抑制致病菌的繁殖。

總之，酪酸梭菌及其代謝產(chǎn)物丁酸鹽既能維護(hù)ANP并發(fā)IAH大鼠的腸屏障功能作用，又能調(diào)節(jié)其腸道菌群失衡，兩者相互促進(jìn)、相互補(bǔ)充，這一結(jié)果為益生菌治療SAP并發(fā)IAH提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突