孫乃霞 郭社民

藥品的檢查項目中，微生物限度檢查是一項重要的指標(biāo)，為了使檢驗方法更合理，更能真實地考察藥物的微生物污染情況，國家藥典委員會也不斷地完善微生物檢查法。該法2015年版《中華人民共和國藥典》收載的方法較之前的版本變化較大，比如培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)條件等方面，所以為了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，樣品檢驗時需要重新建立合適的檢驗方法[1，2]。健脾補(bǔ)血顆粒是比較常見、應(yīng)用也比較廣泛的中藥制劑，它收載在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十七冊中。相關(guān)組份有皂礬、黨參、茯苓、黑豆(炒)、神曲茶、甘草、白術(shù)、陳皮等，功能主治為各種類型的貧血，也能和胃、健脾、助消化。本文依照《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定的檢驗方法對健脾補(bǔ)血顆粒微生物限度檢查方法進(jìn)行試驗，尋找合適的檢驗方法，不僅使本樣品檢驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠，也希望能對藥品生產(chǎn)企業(yè)和檢驗監(jiān)督機(jī)構(gòu)提供一些參考。

1 實驗材料

1.1 儀器設(shè)備電熱恒溫培養(yǎng)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，型號：HHBII500-S、揚(yáng)州慧科電子有限公司，型號：GHP-9162)、生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州慧科電子有限公司，型號：SPX-150)、立式滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號：YXQ-LS-50SII)、生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：BSC-1600IIA2、電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司，型號：HZF-AE200)。

1.2 培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號：20170607)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號：20170218)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：20170525)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號：20170605)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號：20170603)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號：20171200)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號：20180220)、麥康凱液體培養(yǎng)基(批號：20171212)、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基(批號：20180402)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(批號：20180623)、三糖鐵瓊脂(批號：20180620)。生產(chǎn)廠家：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。以上培養(yǎng)基的適用性試驗均符合現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

1.3 試驗樣品健脾補(bǔ)血顆粒廠家：河南華峰制藥有限公司，批號：20180401(1號)、20180402(2號)、20180403(3號)。

1.4 試驗菌大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌液的制備金黃色葡萄球菌菌懸液的制備：Ⅰ將金黃色葡萄球菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)20 h，取該培養(yǎng)物適量；Ⅱ用0.9%的無菌氯化鈉溶液配制成菌懸液，再用0.9%的氯化鈉溶液分步稀釋，選取1 ml的含菌量不超過100 cfu的菌懸液備用。枯草芽孢桿菌菌懸液的制備：將枯草芽孢桿菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)20 h，取該培養(yǎng)物適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。銅綠假單胞菌菌懸液的制備：將銅綠假單胞菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)20 h，取該培養(yǎng)物適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。黑曲霉菌懸液的制備：將黑曲霉菌接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，23℃培養(yǎng)6 d，加0.9%無菌氯化鈉溶液5 ml，洗脫孢子，制成孢子懸液。取孢子懸液適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。白色念珠菌菌懸液的制備：將白色念珠菌接種到沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，23℃培養(yǎng)2 d，取該培養(yǎng)物適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。大腸埃希菌菌懸液的制備：將大腸埃希菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)20 h，取該培養(yǎng)物適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。沙門菌菌懸液的制備：將沙門菌接種到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)20 h，取該培養(yǎng)物適量，余下配制方法同上述Ⅱ的操作。

2.2 供試液的制備與稀釋取樣品1號、2號、3號，各稱取10 g分別置于3個勻漿杯中，各加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml作為稀釋液，混勻，制成稀釋濃度為1∶10溶液。取上述溶液適量，分別用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基分步稀釋，將三批樣品均依次制成1∶50、1∶100、1∶1000的供試液備用。

2.3 微生物回收試驗用供試液的制備試驗組：取2.2項制備的三批樣品的4個不同濃度供試液各100 ml，加入2.1項配制的相關(guān)菌液各1 ml，混勻備用。供試品對照組：取2.2項制備的三批樣品的4個不同濃度供試液各100 ml，加入稀釋液代替菌液，與試驗組平行操作，混勻備用。菌液對照組：取稀釋液各100 ml代替供試品，分別加入2.1項配制的相關(guān)菌液各1 ml，與試驗組平行操作，混勻備用。

2.4 供試品中微生物回收(平皿-傾注法)取2.3項制備的三批樣品的試驗組、供試品對照組、菌液對照組各2 ml，注入2個平皿，一個平皿1 ml，傾注相應(yīng)的培養(yǎng)基(溫度不超過45℃)，搖勻，待凝固后倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板為33℃培養(yǎng)3 d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板為23℃培養(yǎng)5 d。觀察，計數(shù)。

2.5 計算回收比值計算方法：試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)，所得差值除以菌液對照組的平均菌落數(shù)。見表1、表2。

表1 需氧菌驗證回收率

表2 霉菌和酵母菌驗證回收率

2.6 計數(shù)方法的確立根據(jù)規(guī)定,比值應(yīng)在0.5～2 范圍內(nèi)[3]。觀察表1：三批樣品均是稀釋級別為1∶100時，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)的5種試驗菌株的回收率都符合規(guī)定；觀察表2：稀釋級別在1∶10時，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)的2種菌株的回收率都符合規(guī)定。所以健脾補(bǔ)血顆粒需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查是應(yīng)選擇最低稀釋級別為1∶100的平皿傾注法；而霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查則宜選取最低稀釋級別為1∶10的供試液的平皿傾注法。

2.7 控制菌檢驗方法適應(yīng)性試驗

2.7.1 大腸埃希菌實驗步驟以一批樣品敘述，其余兩批同法試驗(下同)。取2.2中制備的1∶10的供試液30 ml，分別接種至3份各含100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶10 ml供試液。其中瓶1加入2.1中制備的大腸埃希菌菌懸液1 ml，作為試驗組；瓶2加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml，作為陰性菌對照組；瓶3為供試品組。將上述培養(yǎng)液混勻，33℃培養(yǎng)20 h后，分別將上述培養(yǎng)物接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，接種量為1 ml。43℃培養(yǎng)30 h后，將麥康凱液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物用接種環(huán)劃線接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，33℃培養(yǎng)68 h，觀察，根據(jù)上述3組對應(yīng)平板的菌落生長情況，判斷該法是否可行。

2.7.2 耐膽鹽革蘭陰性菌取2.2中制備的1∶10的供試液10 ml，置23℃培養(yǎng)2 h，使其中的細(xì)菌充分恢復(fù)。取供試液4 ml，分別接種至4支盛有10 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基的試管中，每支1 ml供試液，其中管1加入2.1中制備的大腸埃希菌菌懸液1 ml作為試驗組a；管2加入2.1中制備的銅綠假單胞菌菌懸液1 ml為試驗組b；管3加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液1 ml為陰性菌對照組；管4為供試品組。將4管置33℃培養(yǎng)38 h，然后劃線接種在紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，置33℃培養(yǎng)22 h。觀察，根據(jù)4組對應(yīng)平板上菌落生長情況，判斷該法是否可行。

2.7.3 沙門菌取樣品30 g，分別接種于3瓶含胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 ml的三角瓶中，每瓶樣品10 g，混勻，其中瓶1加入2.1中制備的沙門菌菌懸液1 ml作為試驗組；瓶2加入2.1中制備的金黃色葡萄球菌菌懸液為陰性菌對照組；瓶3為供試品組。將各組混勻，33℃培養(yǎng)22 h。將3組培養(yǎng)物各取0.1 ml，分別接種至含10 ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基的試管中，33℃培養(yǎng)22 h。取RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物用接種環(huán)接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板之上，置33℃培養(yǎng)45 h。觀察，根據(jù)3組對應(yīng)平板上的菌落生長情況，判斷該法是否可行。

2.7.4 大腸埃希菌試驗結(jié)果三批樣品中：加入陽性菌的試驗組經(jīng)過培養(yǎng)，平板上均有菌生長，且經(jīng)鑒定，該菌即為所加陽性菌；而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng)，平板上均未見有菌生長，說明本次試驗建立的常規(guī)法對大腸埃希菌的選擇性很好，此法可行，可用于該項目的檢驗。見表3。

表3 大腸埃希菌試驗結(jié)果

2.7.5 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗結(jié)果3批樣品中，加入陽性菌的2個試驗組a、b經(jīng)過培養(yǎng)，平板上均有菌生長，且經(jīng)鑒定，該菌即為所加陽性菌；而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng)，平板上均未見有菌生長，說明本次試驗建立的常規(guī)法對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的選擇性都良好，此法可行，可用于該項目的檢驗。見表4。

表4 耐膽鹽革蘭陰性菌試驗結(jié)果

2.7.6 沙門菌試驗結(jié)果三批樣品中：加入陽性菌的試驗組經(jīng)過培養(yǎng)，平板上均有菌生長，且經(jīng)鑒定，該菌即為所加陽性菌；而加入陰性對照菌的一組和供試品一組經(jīng)培養(yǎng)，平板上均未見有菌生長，說明本次試驗建立的常規(guī)法對沙門菌的選擇性很好，此法可行，可用于該項目的檢驗。見表5。

表5 沙門菌試驗結(jié)果

3 討論

微生物限度檢查法是從《中華人民共和國藥典》2005年版開始引入方法驗證試驗[4]，方法驗證的提出，使檢驗更有邏輯性，也使檢驗結(jié)果更加真實可靠。近十幾年來，中國藥典委員會不斷對方法驗證的實驗體系進(jìn)行改進(jìn)、完善，相對于前版來說，現(xiàn)行《藥典》在非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查部分，變動較大，為了確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢驗方法都需要重新驗證[5]。

本樣品是顆粒劑，通常顆粒劑是經(jīng)過提取，檢驗時相對來說影響因素較少，干擾因素也少，可本樣品不同，為了使菌落能更好的生長，本文選擇了胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋液[6]。

為了更方便計數(shù)，檢查需氧菌總數(shù)計數(shù)時可以用陶瓦蓋代替平皿的玻璃蓋[7]。

本版《藥典》在控制菌檢查方法適用性試驗中首次提出了陰性菌對照，同供試品檢查方法中的陰性對照不同，陰性對照菌更加體現(xiàn)了培養(yǎng)體系的專屬性，也使檢驗結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠[8]。