冀照君 穆莎茉莉 張繼星

摘要 蓖麻餅粕經(jīng)105 ℃烘干2 h并粉碎至40目后，采用中性蛋白酶對蓖麻餅粕蛋白進(jìn)行酶解，采用響應(yīng)面法對酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)酶用量為6.2 IU/mg（以物料質(zhì)量計）、底物濃度（物料蛋白∶水）為6.0% 、溫度為45 ℃、pH為7.4、水解3.8 h時，蓖麻蛋白水解效果較好，水解度達(dá)8.16%。經(jīng)冷水浸提過濾及離心處理，所得蛋白酶解液中蓖麻堿去除率為83.19%，其他毒素未檢出。該酶解工藝有效去除了蓖麻毒素，進(jìn)一步拓寬了蓖麻餅粕的利用空間。

關(guān)鍵詞 蓖麻餅粕;蛋白酶;酶解;毒素

中圖分類號 TS209文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0156-04

Abstract Castor meal was smashed to 40mesh at 105? ℃ for 2 h，and hydrolyzed with neutral protease.Then response surface methodology was used for optimizing the hydrolytic conditions.The results showed that good hydrolytic effectiveness was obtained and the degree of hydrolysis （DH） reached 8.16%，under the optimal conditions of enzyme dosage 6.2 IU/mg （calculated by material quality），substrate concentration 6.0% （the rate of protein to water），temperature 45? ℃，pH 7.4 and reaction time 3.8 h.The removal rate of ricin was 83.19% and the content of other toxins was not detected in protein hydrolyzates，which was extracted by cold water and centrifuged.The enzymatic hydrolysis technology could remove ricin effectively，and further broaden the availability of castor cake meal.

Key words Castor meal;Protease;Enzymolysis;Toxin

蓖麻（Aicinus communis L.）屬大戟科蓖麻屬喜溫植物，種質(zhì)資源十分豐富[1]。蓖麻籽粒經(jīng)榨油后所得的廢棄物稱為蓖麻餅粕。Gionbelli等[2]研究發(fā)現(xiàn)蓖麻餅粕中尚存在4種毒素物質(zhì)，即蓖麻毒蛋白、血球凝集素、變應(yīng)原和蓖麻堿，嚴(yán)重阻礙了進(jìn)一步的加工利用，主要被當(dāng)做農(nóng)田肥料施加到田間，只有少量添加到動物飼料中[3-4]。為了開拓蓖麻餅粕的在食品工業(yè)中的利用空間，很多學(xué)者對蓖麻餅粕的成分進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻餅粕除含有粗纖維、碳水化合物外，還含有豐富的粗蛋白（含量高達(dá)33%～35%）、多種礦物質(zhì)元素（如鈣、鋅、鐵等），是一種天然的優(yōu)質(zhì)資源[5]。蓖麻餅粕的脫毒工藝研究一直是學(xué)者們關(guān)注的問題[6-8]，迄今已研究出多種蓖麻餅粕的脫毒方法[9]。但關(guān)于蓖麻餅粕粗蛋白的再利用研究報道甚少，2015年于麗娜等[10]首次采用蛋白酶對蓖麻蛋白進(jìn)行了酶解處理并測定了產(chǎn)物的抗氧化特性，但未測定產(chǎn)物中毒素的含量。蓖麻餅粕中除蓖麻堿外，其他毒素分子中均含有蛋白質(zhì)長鏈結(jié)構(gòu)，高溫變性后很容易受到蛋白酶分解而去除，純蓖麻堿則微溶于冷水，可以通過低溫離心法去除[11]。筆者采用蛋白酶在最適條件下對高溫變性后的蓖麻餅粕進(jìn)行處理，不僅可以破壞毒素的分子結(jié)構(gòu)，去除毒素，而且還能使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)殡幕虬被幔子谙?，分解后的蛋白質(zhì)可以很好地溶于水中，然后將水解液冷卻離心，得到無毒的蓖麻水解粗提液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。蓖麻餅粕，購自通遼通化化工有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備。PHS-3C型精密pH計，為上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品; KDN-04C型凱氏定氮儀，為鄭州南北儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總氮量的測定。總氮量的測定采用微量凱氏定氮法[12]。

1.2.2 氨基氮含量的測定。氨氫氮含量的測定采用甲醛滴定法[13]。取5 mL蓖麻餅粕蛋白酶解后產(chǎn)物，加入60 mL蒸餾水并攪拌10 min。用已標(biāo)定的0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH為8.2，并保持1 min，緩慢加入甲醛10 mL并攪拌3 min。然后，再次滴定至溶液pH為9.2，記氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V1。

同時，取另外5 mL酶解前的蓖麻餅粕溶液作為空白對照，按照上述方法進(jìn)行滴定，記氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V0。按照以下公式計算氨氨基氮含量：

式中，V1為滴定酶解后產(chǎn)物消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）;V0為滴定酶解前溶液消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）;C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度;14.008為氫氧化鈉中氮當(dāng)量常數(shù)，單位為mg/mL;5為所取樣品的體積，單位為mL。

1.2.3 水解度的計算。

采用水解度作為蓖麻餅粕蛋白酶解工藝優(yōu)化的指標(biāo)，水解度的計算公式[14]如下：

1.3 工藝流程及操作要點。

1.3.1 工藝流程。工藝流程如圖1所示。

1.3.2 主要操作要點。

1.3.2.1 原料烘干及粉碎。

由于榨油后的蓖麻餅粕中含有一定的水分，并且顆粒較大，因此需要將餅粕進(jìn)行初步烘干并粉碎至所需的粒度。將蓖麻餅粕于105 ℃下烘干2 h，采用高速粉碎機(jī)粉碎至40目[15]，待用。

1.3.2.2 酶解。

將上述預(yù)處理原料中加入蒸餾水制成一定濃度的混合物，然后勻漿處理，底物濃度（以物料中蛋白質(zhì)含量所占百分比計）分別為3%、4%、5%、6%、7%;調(diào)節(jié)pH，加入一定量的中性蛋白酶在設(shè)定好的溫度下進(jìn)行酶解，酶用量分別為3、4、5、6、7 IU/g，以水解度為指標(biāo)，研究蓖麻蛋白酶解的最佳工藝條件。每個處理重復(fù)3次，試驗結(jié)果均取3次重復(fù)的平均值。

1.3.2.3 滅酶。

滅酶的目的是防止酶解過程影響水解度的測定結(jié)果。采用90 ℃加熱5 min的方式，以滅掉蛋白酶的活性。

1.3.2.4 粗肽液分離及毒素檢測。

酶解后，將混合物進(jìn)行8層紗布過濾，然后緩慢冷卻至2～4 ℃，使蓖麻堿逐漸形成不溶性晶體而析出，通過冷凍離心（8 000 r/min，10 min）去除不溶解成分，取上清液即為粗肽液，血球凝集素、蓖麻毒蛋白、變應(yīng)原的提取及檢測采用高效液相色譜法[16]，蓖麻堿的檢測采用紫外分光光度法[11]。

1.4 試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在酶解過程中酶用量、底物濃度、酶解溫度、酶解時間對酶解效果的影響較為顯著，而pH對酶解效果的影響較小，因此以酶用量、底物濃度、酶解溫度和酶解時間4個因素為自變量（x），以水解度為響應(yīng)值（Y），利用Design-Expert 7.1軟件的中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計[17]，共進(jìn)行31個試驗點，取3次平行試驗的平均值。中心旋轉(zhuǎn)組合因素與水平設(shè)計見表1。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用Design-Expert 7.1軟件和Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

1.6 模型的驗證

通過響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化蓖麻餅粕酶解的工藝條件，并在模型預(yù)測的最優(yōu)條件下再次對蓖麻餅粕蛋白進(jìn)行酶解，比較預(yù)測值和試驗過程中的測定值來驗證模型適用于該研究的程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的擬合 中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗結(jié)果見表2。

蓖麻餅粕蛋白酶解工藝采用RSM優(yōu)化法建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，蓖麻餅粕蛋白水解度的回歸方程如下：

通過上述回歸模型計算出的蓖麻餅粕蛋白水解度預(yù)測值Y與實際試驗過程中所測定得到的水解度進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，該回歸方程所計算的預(yù)測值與實際測定值擬合良好，因此該方程可用于評估蓖麻餅粕蛋白的酶解工藝參數(shù)和酶解結(jié)果。

2.2 自變量對響應(yīng)值的影響

蓖麻餅粕蛋白酶解后所得水解度受回歸方程中回歸系數(shù)的影響。由表3可知，x1、x2、x3、x4、x3x4、x12、x22、x32、x42項對水解度有顯著影響，其他因素的影響不顯著。根據(jù)回歸方程的原理，一次項回歸系數(shù)對水解度的影響最大，其絕對值大小依次分別為x4、x1、x2、x3。這表明影響蓖麻餅粕蛋白水解度最主要因素為酶解時間，其次為酶用量、底物濃度、酶解溫度。為了形象地描述各因素對響應(yīng)值的影響，各因素對水解度影響的響應(yīng)值見圖3～8。

2.3 最適條件和回歸模型的驗證

通過該回歸模型，采用Design expert 7.1軟件優(yōu)化蓖麻餅粕蛋白酶解條件，得出最適工藝條件：酶用量6.2 IU/mg、底物濃度6.0%、酶解溫度45 ℃、酶解時間3.8 h，并調(diào)節(jié)pH至7.4，在此條件下蓖麻餅粕蛋白水解度的預(yù)測值為8.20%，而實際測得的水解度為8.16%，實際值與預(yù)測值之間的相對誤差為0.04%，差異不顯著。

將粗提液采用高效液相色譜法進(jìn)行測定后，發(fā)現(xiàn)蓖麻毒蛋白、變應(yīng)原、血球凝集素的毒素均未檢出，蓖麻堿去除率為83.19%。因此，采用RSM法優(yōu)化得到的工藝條件可以有效去除蓖麻餅粕中的各種毒素。

3 結(jié)論與討論

蓖麻餅粕作為蓖麻籽榨油后的廢棄產(chǎn)品，絕大部分作為肥料施加到田間[5，9]，只有少量餅粕添加到動物飼料[6，9]，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)，因此蓖麻餅粕的再利用一直備受研究者們的關(guān)注。烘干并粉碎后的蓖麻餅粕經(jīng)中性蛋白酶處理后，水解度可達(dá)8.16%。采用水洗法去除了酶解產(chǎn)物中83.19%的蓖麻堿，其他毒素均未檢出。該研究中酶用量和底物濃度對蓖麻餅粕水解度的影響較為顯著，蓖麻餅粕經(jīng)過105 ℃烘干后，蓖麻毒蛋白、血球凝集素、變應(yīng)原及其他蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)部分已變性，酶結(jié)合位點充分暴露，中性蛋白酶可以有效降解蛋白質(zhì)大分子[10]，分解為多肽或氨基酸含量較高的酶解產(chǎn)物，這與大豆蛋白酶解過程相似[19]。該試驗中酶解時間對蓖麻餅粕蛋白水解度的影響也很大，這可能是由于蓖麻餅粕中部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，如糖結(jié)合蛋白[4]，酶反應(yīng)速度相對緩慢。另外，采用已有的水洗法去除酶解產(chǎn)物殘存的蓖麻堿，可避免其他營養(yǎng)成分的丟失[11]?？偠灾?，采用酶解的方法對蓖麻餅粕進(jìn)行處理，不僅可以去除毒素，而且豐富了酶解產(chǎn)物的營養(yǎng)成分，易于消化吸收，極大地拓寬了蓖麻餅粕的進(jìn)一步利用空間。

參考文獻(xiàn)

[1] 王芳，陳巧紅，董樂，等.蓖麻 3-磷酸甘油醛脫氫酶的基因克隆及表達(dá)分析[J].分子植物育種，2018，16（24）：7965-7974.

[2] GIONBELLI T R S，VELOSO C M，GIONBELLI M P，et al.Utilization of castor bean meal treated with calcium hydroxide，fed wet or dry，by lambs[J].Livestock science，2014，168：76-83.

[3] 劉寧，張柏林，竇全麗，等.蓖麻毒素結(jié)構(gòu)及其活性檢測方法研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（18）：33-35.

[4] THORNTON S L，DARRACQ M，LO J，et al.Castor bean seed ingestions：A statewide poison control system's experience[J].Clinical toxicology，2014，52（4）：265-268.

[5] 冀照君，李華，賈娟霞，等.蓖麻餅粕中有效成分的開發(fā)利用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（32）：170-171，174.

[6] 蘇雅拉圖，王雪珊，韓玉萍，等.蓖麻餅粕提取干酪素及制膠初探[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，32（3）：215-219.

[7] 任春燕，卜登攀，王加啟，等.脫毒蓖麻粕對奶牛瘤胃發(fā)酵和營養(yǎng)物質(zhì)消化的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，49（1）：15-20.

[8] 楊明冠，李貞景，李建軍，等.蓖麻油浸提同步蓖麻餅粕脫毒技術(shù)的研究[C]//中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第十三屆年會論文集.北京：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會學(xué)術(shù)部，2016：452-453.

[9] 張樹軍，狄建軍，白靚，等.蓖麻餅粕的脫毒及綜合開發(fā)利用[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，26（5）：549-551.

[10]于麗娜，許婷婷，張玉鳳，等.蓖麻限制性酶解蛋白功能特性和抗氧化活性研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6（6）：2188-2194.

[11] 穆莎茉莉，陳永勝，黃鳳蘭，等.水洗法去除蓖麻餅粕中蓖麻堿工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（7）：239-242.

[12] 趙新淮，馮志彪.大豆蛋白水解物水解度測定的研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，26（2）：178-181.

[13] 徐勤，葛向陽，劉建峰.甲醛法測大豆蛋白水解度的改進(jìn)[J].飼料工業(yè)，2008，29（5）：46-47.

[14] ALDERNISSEN J.Enzymatic hydrolysis of food protein[M].London：Elsevier Applied Science Publishers，1986：12-14.

[15] 蘇雅拉圖，陳宇杰，穆莎茉莉，等.蓖麻餅粕提取氨基酸及酸水解法優(yōu)化初探[J].食品工業(yè)科技，2014，35（3）：192-194，198.

[16] 葉鋒，王德潤.蓖麻毒素的毒性和毒素的分離及檢測方法[J].中國油料作物學(xué)報，2004，26（1）：89-93.

[17] 王欽德，楊堅.食品試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003.

[18] JOGLEKAR A M，MAY A T.Product excellence through design of experiments[J].Cereal foods word，1987，32（12）：857-868.

[19] 竇屾，廖永紅，楊春霞，等.微波預(yù)處理對脫脂豆粕蛋白水解度的影響[J].食品科學(xué)，2012，33（2）：119-123.