李巧巧 龐文 穎海力

摘要 [目的]研究Cdh1和Num1之間是否存在相互作用，構(gòu)建用于Cdh1和Num1免疫共沉淀試驗的過表達(dá)菌株。[方法]首先在酵母菌株YWL630中用GAL1和3HA對CDH1進(jìn)行標(biāo)記，構(gòu)建GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株，再利用酵母四分體解離的方法使菌株YWL63和YWL490分別與該菌株雜交并進(jìn)行四分體解離，從而得到所需菌株。[結(jié)果]成功構(gòu)建不同基因型和配型的重組酵母菌株，其中YT52成功過表達(dá)了約340 kD的Num1，YT53成功過表達(dá)了340 kD的Num1和75 kD的Cdh1，YT57成功過表達(dá)了75 kD的Cdh1。[結(jié)論]經(jīng)過同源重組的方法成功標(biāo)記CDH1并誘導(dǎo)蛋白過表達(dá)，通過酵母四分體解離的方法構(gòu)建用于Cdh1和Num1互作試驗的過表達(dá)菌株，為揭示APC/C是否介導(dǎo)Num1的降解及機制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 過表達(dá);酵母四分體解離;Cdh1;Num1

中圖分類號 Q26文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0001-04

Abstract [Objective] To study whether there is an interaction between Cdh1 and Num1， and construct an overexpression strain for Cdh1 and Num1 coimmunoprecipitation experiments. [Method] Firstly， CDH1 was labeled with GAL1 and 3HA in yeast strain YWL630 to construct GAL13HACDH1 NUM1GFP strain， and then yeast YWL63 and YWL490 were hybridized with the strain by yeast tetrad dissection method. The tetrad dissection was carried out to obtain the desired strain. [Result] The recombinant yeast strains with different genotypes and mating types were successfully constructed. YT52 successfully overexpressed Num1 with a size of about 340 kD. YT53 successfully overexpressed 340 kD Num1 and 75 kD Cdh1， and YT57 successfully overexpressed 75 kD of Cdh1. [Conclusion]The method of homologous recombination successfully labeled CDH1 and induced protein overexpression， and constructed an overexpression strain for Cdh1 and Num1 interaction experiments by yeast tetrad dissection thereby laying the foundation for revealing whether APC/C mediates the degradation of Num1 and its mechanism.

Key words Overexpression;Yeast tetrad dissociation;Cdh1;Num1

在不對稱細(xì)胞分裂期間，有絲分裂紡錘體必須正確適當(dāng)?shù)囟ㄏ?，以確保細(xì)胞命運決定因子準(zhǔn)確地分配到每個子細(xì)胞[1]。在芽殖酵母的有絲分裂中，細(xì)胞膜錨定的dynein對細(xì)胞質(zhì)微管施加拉力，將有絲分裂紡錘體移動到芽體頸部，而dynein的錨定則需要Num1[2]。Num1（nuclear migration 1，核遷移）[3-5]是一個313 kD的大分子蛋白質(zhì)，含有N-末端卷曲螺旋（CC）結(jié)構(gòu)域，中間一個EF hand motif，12個由64個氨基酸組成的重復(fù)區(qū)域以及C-末端pleckstrin同源性（PH）結(jié)構(gòu)域[6]。Num1定位于細(xì)胞膜，并與dynein相互作用。其中，CC結(jié)構(gòu)域直接與線粒體膜相互作用，也是Num1和動力蛋白相互作用所必需的，而與PI4，5P2高度特異性結(jié)合的PH結(jié)構(gòu)域?qū)um1錨定到細(xì)胞質(zhì)膜上[6-10]。

APC/C（anaphase-promoting complex）是一種多亞基E3泛素連接酶，負(fù)責(zé)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白在中期到后期和有絲分裂期到G1期過渡中的泛素化[11-13]。APC/C在細(xì)胞周期的不同階段分別由2種特異性激活因子Cdh1和Cdc20調(diào)控[14-15]，只有與共激活因子相結(jié)合時，APC/C在細(xì)胞周期中才能起到泛素化Cyclins的作用。研究表明，具有活性的APC/C作用底物具有2種共同的降解基序：D box和KEN motif。這些底物通過這種降解基序特異性結(jié)合APC/C及其共激活因子復(fù)合物[16-18]。

前期通過對Num1進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)Num1序列中包含數(shù)個分別與APC的激活蛋白Cdh1和Cdc20結(jié)合的保守基序KEN motif和D box，意味著Num1的降解可能與APC/C有關(guān)。因此，通過檢測APC共激活因子與Num1之間有無相互作用，進(jìn)而了解APC/C是否可能介導(dǎo)Num1的降解。該研究利用同源重組原理先在YWL630菌株中成功構(gòu)建Gal-3HA-Cdh1重組蛋白，接著采取酵母四分體解離的方法構(gòu)建COIP所需過表達(dá)菌株。在利用四分體分析技術(shù)的研究中，常采用釀酒酵母作為試驗對象。2個配型不同的親代酵母菌株雜交而產(chǎn)生4個黏在一起的子代酵母，稱為四分體。為了使這個四分體分開稱為4個單獨的孢子，利用四分體解離顯微鏡在物理上進(jìn)行孢子解離，繼而經(jīng)過篩選獲得不同基因型。

筆者通過構(gòu)建過表達(dá)Cdh1和Num1菌株，通過免疫共沉淀試驗檢測Cdh1和Num1的相互作用，旨在為揭示APC/C是否介導(dǎo)Num1的降解及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。

DH5α大腸桿菌細(xì)胞（北京鼎國昌盛）;釀酒酵母YWL630基因型：MATa Num1-yEGFP∷spHIS5 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;YWL490基因型：MATα TRP1-GAL1-Num1-YFP-HIS ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;YWL63基因型：MATα DYN1-3GFP∷TRP1 ura3-52 lys2-801 leu2-Δ1 his3-Δ200 trp1-Δ63;質(zhì)粒PFA6a-TRP1-GAL1-3HA。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑。

YPD培養(yǎng)基和缺乏相應(yīng)氨基酸的SD（synthetic define）培養(yǎng)基;LithiumSorb溶液：10 mmol/L LioAC，100 mmol/L Sorbitol，10 mmol/L Trisbase，1 mmol/L EDTA，pH 8.0;PEG溶液：10 mmol/L LioAC，40% PEG，10 mmol/L Trisbase，1 mmol/L EDTA，pH 8.0;轉(zhuǎn)膜液：190 mmol/L Glycine，0.05% SDS，25 mmol/L Trisbase，10%甲醇;TBST溶液：300 mmol/L NaCl，50 mmol/L Trisbase，0.05% Tween 20，pH 8.0。

1.2 方法

1.2.1 GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株的構(gòu)建。

1.2.1.2

酵母感受態(tài)的制備。從-80 ℃冰箱將菌株拿出在YPD固體培養(yǎng)基上劃線置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d后，挑菌至3 mL YPD液體培養(yǎng)基中放置于30 ℃搖床，200 r/min培養(yǎng)24 h左右;次日吸取3 μL菌液至新的30 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min搖床中培養(yǎng)至對數(shù)期（OD600為0.6左右）即可收集;將30 mL對數(shù)期生長的YWL630細(xì)胞3 000 r/min離心3 min后棄上清，用10 mL滅菌水清洗細(xì)胞，3 000 r/min離心1 min棄上清。再用3 mL LithiumSorb溶液懸浮細(xì)胞，3 000 r/min離心2 min，吸棄上清;向沉淀中加入360 μL LithiumSorb和40 μL鮭魚精子DNA（作為載體DNA，制備感受態(tài)之前將其在沸水中煮10 min后放回冰上冷卻至0 ℃）懸浮細(xì)胞，再分裝到新的1.5 mL EP管中，每管100 μL左右，放置在-80 ℃保存。

1.2.1.3 轉(zhuǎn)化。從-80 ℃冰箱將近期制備的YWL630感受態(tài)取出置于冰上，接著吸取10 μL用于轉(zhuǎn)化的PCR產(chǎn)物加入到100 μL 感受態(tài)細(xì)胞中輕輕混勻，再加入600 μL PEG溶液混勻，在室溫下靜置30 min;加入38 μL二甲基亞砜（DMSO）混勻后在42 ℃水浴中熱激5 min;3 000 r/min離心2 min，吸棄上清;向白色沉淀中加入50 μL滅菌水重懸細(xì)胞，將細(xì)胞均勻涂布在含有G418（0.02 mg/mL）抗性的YPD固體培養(yǎng)基上，用封口膜封口并倒置在30℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d等待克隆長出。

1.2.1.4 克隆的篩選。待單克隆長出后，挑取其中數(shù)個劃線在篩選固體培養(yǎng)基上置于30 ℃培養(yǎng)，此為第一次劃線;等待2～3 d克隆長出后，重復(fù)一次劃線，此為第二次劃線。從第二次劃線的培養(yǎng)基上挑取4個克隆擴大培養(yǎng)，待提取總蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組轉(zhuǎn)化子的過表達(dá)鑒定。

1.2.2.1 酵母過表達(dá)菌株的細(xì)胞培養(yǎng)。從-80 ℃冰箱將菌株取出，在YPD固體培養(yǎng)基上劃線并置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d;待克隆長出后，第1天挑取適量菌落至3 mL YPD液體培養(yǎng)基中并放置于30 ℃搖床，200 r/min培養(yǎng)24 h左右;細(xì)胞長至飽和后，吸取4 μL菌液至含2%（W/V）棉子糖（Raffinose）的液體YPA培養(yǎng)基中，置于搖床中200 r/min、30 ℃培養(yǎng)16 h;接著將細(xì)胞3 000 r/min離心1 min后棄上清，向沉淀中加入含2%（W/V）半乳糖（Galactose）的液體YPA培養(yǎng)基，繼續(xù)置于30 ℃搖床中培養(yǎng)4 h左右即可收集細(xì)胞。

1.2.2.2 TCA法提取總蛋白。從培養(yǎng)好的對數(shù)期細(xì)胞中吸取1.5 mL菌液至1.5 mL收集管中，3 000 r/min離心2 min后棄上清繼續(xù)3 000 r/min離心1 min，吸棄上清并收集沉淀;向沉淀中加入100 μL 20%的三氯乙酸（TCA）重懸混勻后，再加入直徑1 mm的玻璃珠至與液面相平，放在冰上靜置短暫時間;室溫下用細(xì)胞振蕩破碎儀破碎2 min，其中每破碎1 min后即刻將收集管在冰上靜置冷卻1 min;接著用針頭在收集管底部戳一個小孔，并將其插入另一個新的1.5 mL EP管中，置于4 ℃冷凍離心機中3 000 r/min離心3 min后丟棄裝有玻璃珠的收集管;繼續(xù)將裝有細(xì)胞裂解液的1.5 mL EP管3 000 r/min離心5 min后，收集沉淀;向白色沉淀中加入40 μL 2x Protein Loading Buffer和40 μL Tris-HCl（pH 8.0），用移液器吹打混勻后，封口膜封口并繼續(xù)靜置于冰上;將離心管放置于煮沸的100 ℃水中煮5 min后，12 000 r/min離心1 min，上清用于蛋白質(zhì)免疫印跡分析或保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 Western Blot分析。

在常規(guī)的蛋白免疫印跡分析中，蛋白經(jīng)10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳（SDS-PAGE，配方見表1）分離后，使用半干轉(zhuǎn)膜儀在含10%甲醇的轉(zhuǎn)膜液中轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。蛋白膜用含5%脫脂奶粉的TBST溶液浸泡輕搖1 h后用HA抗體（THETMc-HA Tag Antibody，mAb，Mouse，GenScript）或GFP抗體（Mouse Anti GFP Monoclonal-Antibody，興華基因）室溫下孵育2 h，TBST溶液洗滌3次，每次10 min，再用二抗室溫下孵育1 h。結(jié)合了抗體的蛋白膜用TBST溶液洗滌3次，每次10 min，隨后用ECL超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒染色，再用凝膠成像儀曝光檢測。

1.2.3 重組菌株基因組DNA的提取及PCR鑒定。

1.2.4 酵母四分體解離法構(gòu)建重組過表達(dá)菌株及表達(dá)鑒定。

（1）親代酵母菌株的雜交：將-80 ℃冰箱取出的酵母菌株YT23（α）、YWL63（a）、YWL490（a）在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，倒置30 ℃恒溫箱培養(yǎng)1～2 d;待菌落長出后，用1 mL槍頭分別挑取配型不同的YT23和YWL63以及YT23和YWL490一小塊菌落混勻在新的YPD培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后用槍頭挑取適量菌落轉(zhuǎn)移至3 mL SPM液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)3～4 d。

（2）酵母細(xì)胞壁的處理：吸取70 μL細(xì)胞液3 000 r/min離心1 min收集沉淀，加入100 μL Lisorb和7.5 μL Zymolase輕輕混勻。37 ℃恒溫箱處理8 min 30 s，吸取20 μL滴至YPD固體培養(yǎng)基一側(cè)使之從上往下順流，待菌液稍干即可用于四分體的解離。

（3）四分體的解離和篩選：使用酵母解離顯微鏡MSM400操作系統(tǒng)對四分體進(jìn)行分離，詳細(xì)步驟見Singer MSM System 400說明書，完成后置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)1～2 d。為了篩選所需要的基因型：GAL1-NUM1-YFP、GAL1-NUM1-YFP GAL1-3HA-CDH1、GAL1-3HA-CDH1，將YPD培養(yǎng)基上生長的孢子復(fù)制到SD-HIS、SD-TRP、含G418（20 mg/mL）抗性的YPD以及SC固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d，具體篩選情況見表2。

（4）將篩選得到的菌落轉(zhuǎn)移至3 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集對數(shù)期細(xì)胞提取總蛋白并進(jìn)行Western Blot鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAL-3HA-Cdh1 Num1-GFP重組菌株的構(gòu)建和表達(dá)鑒定

3 結(jié)論與討論

該研究旨在構(gòu)建過表達(dá)Cdh1和Num1的重組菌株用于后期試驗。首先在CDH1位點前插入過表達(dá)啟動子、蛋白標(biāo)簽和篩選標(biāo)記，通過半乳糖誘導(dǎo)使該蛋白過表達(dá)，成功構(gòu)建了GAL-3HA-CDH1 NUM1-GFP重組菌株。使用酵母四分體解離技術(shù)的方法構(gòu)建了不同基因型的重組菌株，并從中篩選研究中所需要的菌株，經(jīng)過Western Blot分析，已驗證Cdh1和Num1蛋白成功過表達(dá)且每個菌株中基因型也是正確的。

該試驗中，根據(jù)酵母菌株的構(gòu)建總結(jié)了以下經(jīng)驗：首先需要熟練掌握同源重組原理設(shè)計擴增引物用于轉(zhuǎn)化插入基因組正確位點。其次，每一個步驟均要嚴(yán)格控制，如缺陷型固體培養(yǎng)基的配制、引物擴增的條件、感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化等過程中細(xì)節(jié)的控制十分重要。另一方面，四分體解離的方法與同源重組轉(zhuǎn)化的方法相比，該方法步驟簡單，試驗周期較短，成功率較高。此方法的熟練使用為以后重組菌株的構(gòu)建提供了便利，重組蛋白的成功構(gòu)建為Num1 在細(xì)胞周期中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] BOWMAN S K，NEUMLLER R A，NOVATCHKOVA M，et al.The drosophila NuMA homolog mud regulates spindle orientation in asymmetric cell division[J].Developmental cell，2006，10（6）：731-742.

[2] FARKASOVSKY M，KNTZEL H.Yeast Num1p associates with the mother cell cortex during S/G2 phase and affects microtubular functions[J].The journal of cell biology，1995，131（4）：1003-1014.

[3] BLOOM K.Nuclear migration：Cortical anchors for cytoplasmic dynein[J].Current biology，2001，11（8）：326-329.

[4] FARKASOVSKY M，KNTZEL H.Cortical Num1p interacts with the dynein intermediate chain Pac11p and cytoplasmic microtubules in budding yeast[J].The journal of cell biology，2001，152（2）：251-262.

[5] KORMANEC J，SCHAAFFGERSTENSCHLGER I，ZIMMERMANN F K，et al.Nuclear migration in Saccbaromyces cerevisiae is controlled by the highly repetitive 313 kDa NUM1 protein[J].Molecular and general genetics，1991，230（1/2）：277-287.

[6] TANG X Y，GERMAIN B S，LEE W L.A novel patch assembly domain in Num1 mediates dynein anchoring at the cortex during spindle positioning[J].The journal of cell biology，2012，196（6）：743-756.

[7] LACKNER L L，PING H，GRAEF M，et al.Endoplasmic reticulumassociated mitochondriacortex tether functions in the distribution and inheritance of mitochondria[J].Proceedings of the national academy of sciences，2013，110（6）：458-467.

[8] PING H A，KRAFT L M，CHEN W T，et al.Num1 anchors mitochondria to the plasma membrane via two domains with different lipid binding specificities[J].The journal of cell biology，2016，213（5）：513-524.

[9] TANG X Y，PUNCH J J，LEE W L.A CAAX motif can compensate for the PH domain of Num1 for cortical dynein attachment[J].Cell cycle，2009，8（19）：3182-3190.

[10] STEGMEIER F，RAPE M，DRAVIAM V M，et al.Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities[J].Nature，2007，446（7138）：876-881.

[11] STEVERMANN L，LIAKOPOULOS D.Molecular mechanisms in spindle positioning：Structures and new concepts[J].Current opinion in cell biology，2012，24（6）：816-824.

[12] BOCHIS O V，F(xiàn)ETICA B，VLAD C，et al.The importance of ubiquitin E3 ligases，SCF and APC/C，in human cancers[J].Clujul medical，2015，88（1）：9-14.

[13] PESIN J A，ORRWEAVER T L.Regulation of APC/C activators in mitosis and meiosis[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2008，24：475-499.

[14] ZACHARIAE W，NASMYTH K.Whose end is destruction：Cell division and the anaphasepromoting complex[J].Genes Dev，1999，13（16）：2039-2058.

[15] PFLEGER C M，KIRSCHNER M W.The KEN box：An APC recognition signal distinct from the D box targeted by Cdh1[J].Genes & development，2000，14（6）：655-665.

[16] HUANG J N，PARK I，ELLINGSON E，et al.Activity of the APCCdh1 form of the anaphasepromoting complex persists until S phase and prevents the premature expression of Cdc20p[J].The journal of cell biology，2001，154（1）：85-94.

[17] SETHI N，MONTEAGUDO M C，KOSHLAND D，et al.The CDC20 gene product of Saccharomyces cerevisiae，a betatransducin homolog，is required for a subset of microtubuledependent cellular processes[J].Molecular & cellular biology，1991，11（11）：5592-5602.

[18] QIN L，GUIMARES D S，MELESSE M，et al.Substrate recognition by the Cdh1 destruction box receptor is a general requirement for APC/CCdh1mediated proteolysis[J].Journal of biological chemistry，2016，291（30）：15564-15574.