孫 娜，王 華，朱秀娟，胡文斌，宮崢嶸

(隴南師范高等專(zhuān)科學(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，甘肅 成縣 742500)

五葉草莓(Fragaria Pentaphylla Losinsk) 為薔薇科草莓屬，又名森林草莓、瓢子，是一種多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)秦嶺山脈，資源豐富［1］，市價(jià)可觀，十分暢銷(xiāo)，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民季節(jié)性收入的來(lái)源之一，其果實(shí)主要分為白色和紅色兩種［2］，具有清熱止咳、滋養(yǎng)補(bǔ)血、健脾養(yǎng)胃等藥用價(jià)值［3-4］。但五葉草莓個(gè)頭較普通草莓小，易受擠壓而破損，貯藏運(yùn)輸十分困難，這嚴(yán)重制約了其銷(xiāo)售，造成較大資源浪費(fèi)，故尋求五葉草莓的深加工方法對(duì)其開(kāi)發(fā)與利用具有重要意義。

五葉草莓不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而且含有多種化學(xué)活性物質(zhì)，尤其是黃酮類(lèi)化合物含量極高［5］。生物總黃酮又稱(chēng)黃酮類(lèi)化合物，是廣泛存在于植物界的一大類(lèi)以黃酮為母體的天然有機(jī)化合物，廣泛分布于蔬菜、水果、牧草和藥用植物中，是植物產(chǎn)生的一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類(lèi)化合物具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、延緩衰老、降血糖、降血壓、降血脂及抗炎鎮(zhèn)痛等作用，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)［6-8］。

五葉草莓是我國(guó)特有的一種野生草莓資源［9］，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其已有一定研究，但多是側(cè)重于其人工栽培方面［10］，對(duì)其總黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取卻鮮有報(bào)道。目前對(duì)生物總黃酮的提取方法主要有水浸提法、乙醇浸提法、索氏提取法、滲透法、水蒸氣蒸餾法、超聲波提取法和酶法等。近些年天然活性物質(zhì)提取多借助超聲波輔助技術(shù)，其產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)和空化效應(yīng)等可有效破壞植物細(xì)胞壁，加速有效成分釋放，具有縮短提取時(shí)間和提高產(chǎn)品提取率等優(yōu)點(diǎn)［11-14］。為充分利用野生五葉草莓資源，本研究首次將超聲波提取技術(shù)應(yīng)用于五葉草莓黃酮的提取工藝中，利用Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化五葉草莓總黃酮提取工藝，旨在為五葉草莓總黃酮的提取及綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五葉草莓購(gòu)自隴南成縣市集。選取大小一致、無(wú)破損、無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮五葉草莓，清洗瀝干，放置于45 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒定，粉碎后過(guò)40 目篩，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自成都格利普生物科技有限公司;石油醚、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純，購(gòu)自西安化玻試劑有限公司。

KQ-700E 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司) ;SP-756P 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司) ; Buchi R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng)) ;GZX-9070MBE 型鼓風(fēng)干燥烘箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)) ;400Y 型粉碎機(jī)(永康市展帆工貿(mào)有限公司) ;FA2004N 型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司) 等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取工藝

準(zhǔn)確稱(chēng)取2.00 g 五葉草莓干粉，用索氏回流法脫色、脫脂，按一定的液料比(mL/g) 加入一定濃度乙醇溶液，攪拌均勻，在一定溫度下超聲提取一定時(shí)間，真空抽濾，減壓濃縮至20 mL，濃縮液用一定濃度的乙醇溶液定容至50 mL。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與樣品液總黃酮的測(cè)定

參照錢(qián)慧琴、丁峰等人［15-16］黃酮含量測(cè)定方法來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C 為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為: A =0.0119C+0.0005，R2=0.9995。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

取樣品液與對(duì)照品溶液同法顯色，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值［17-18］。將樣品液吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程中，求得樣品液中的總黃酮質(zhì)量濃度C1。

1.2.3 總黃酮提取率計(jì)算公式

式中，C1為粗提液樣品中五葉草莓黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL;N為稀釋倍數(shù)，量綱為1;V1為粗提樣液總體積，mL;V2為測(cè)定時(shí)取樣體積，mL; M 為五葉草莓樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 總黃酮提取工藝優(yōu)化

(1) 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，分別考察液料比(mL/g) (5 ∶1、10∶1、15∶1、20∶1和25∶1) 、超聲時(shí)間(15 min、20 min、25 min、30 min 和35 min) 、超聲溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃) 和乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%和90%) 這4 個(gè)單因素對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響。

(2) 響應(yīng)曲面(Box-Behnken) 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以五葉草莓黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)，進(jìn)一步考察液料比、超聲時(shí)間、超聲溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響，優(yōu)化提取工藝。響應(yīng)曲面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 液料比對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

液料比對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響如圖2 所示。

從圖2 可知，隨著液料比不斷加大，五葉草莓黃酮提取率呈先升后降趨勢(shì)，當(dāng)液料比達(dá)到10∶1時(shí)，提取率達(dá)到最高。其原因可能是液料比達(dá)到10∶1時(shí)，五葉草莓黃酮已基本完全溶解在乙醇中，繼續(xù)增大液料比，并不利于五葉草莓黃酮的提取，故從提取效率、減少成本等方面綜合考慮，10∶1是合適的液料比。

圖2 液料比對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響如圖3所示。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖3 可知，五葉草莓黃酮提取率在超聲時(shí)間為15 min ～25 min 內(nèi)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，提取率最大，之后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率卻呈下降趨勢(shì)。其原因可能是在超聲處理的前期，超聲波可有效破壞細(xì)胞壁，使活性成分黃酮類(lèi)化合物釋放出來(lái)，但隨著時(shí)間的推移，持續(xù)的超聲產(chǎn)生大量的熱，使熱穩(wěn)定性差的黃酮類(lèi)物質(zhì)被破壞而導(dǎo)致提取率下降，故超聲時(shí)間選取25 min 為宜。

2.1.3 超聲溫度對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

超聲溫度對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響如圖4所示。

圖4 超聲溫度對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖4 可以知，五葉草莓黃酮提取率在超聲溫度為40 ℃～60 ℃內(nèi)緩慢上升，60 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大，當(dāng)超聲溫度超過(guò)60 ℃，提取率急劇下降。其原因可能是黃酮類(lèi)化合物熱穩(wěn)定性較差，但當(dāng)溫度上升到一定值以后，會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)造成破壞，從而影響了五葉草莓黃酮提取率。所以，選擇60 ℃為合適的超聲溫度。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響如圖5所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響

從圖5 可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50% ～60%范圍內(nèi)時(shí)，五葉草莓黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而顯著上升，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %時(shí)提取率最大，之后提取率開(kāi)始下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%以后，提取率又有所上升。其原因可能是黃酮類(lèi)化合物在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類(lèi)，小部分以游離態(tài)苷元形式存在，乙醇溶液與五葉草莓黃酮均屬于極性物質(zhì)，乙醇使黃酮易于被游離提取出來(lái)，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)大可能引起溶出的雜質(zhì)增多，引起黃酮提取率下降［7，19］。所以，確定60%為合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2 響應(yīng)面分析法結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比(X1) 、超聲時(shí)間(X2) 、超聲溫度(X3) 及乙醇體積分?jǐn)?shù)(X4) 4 個(gè)因素為變量，以五葉草莓黃酮提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行了四因素三水平試驗(yàn)(表1) ，試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見(jiàn)表2 和表3。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

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表3 Box-Behnken 試驗(yàn)方差分析

采用Design Expert10 軟件對(duì)表2 和表3 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到黃酮提取工藝參數(shù)回歸模型，其回歸方程為:

從表3 可知，黃酮提取工藝參數(shù)回歸模型的P 值小于0.0001，達(dá)到極顯著水平(P ＜0.01) ，且失擬項(xiàng)P 值=0.1618(＞0.05) ，不顯著，決定系數(shù)R2=0.9748，表明無(wú)失擬因素存在，方程與試驗(yàn)擬合度較好，可用于五葉草莓黃酮提取的分析與預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)方差分析表明，4 個(gè)影響因素對(duì)五葉草莓黃酮類(lèi)物質(zhì)提取率影響的大小順序依次為:液料比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞超聲溫度＞超聲時(shí)間，且方程一次項(xiàng)(X1、X3、X4) 、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)(X1X3) 的影響都是極顯著的(P ＜0.01) ，一次項(xiàng)(X2) 和交互項(xiàng)(X1X2、X1X4、X2X3)的影響都是顯著的(P ＜0.05) ，其余兩項(xiàng)為不顯著。

各因素兩兩交互作用對(duì)黃酮提取率影響的3D 響應(yīng)曲面圖如圖6 所示。響應(yīng)面坡度越陡峭且等高線(xiàn)越接近橢圓形，說(shuō)明因素之間交互作用越明顯，對(duì)五葉草莓黃酮提取的影響也越大，相反則表明因素間交互作用不明顯，對(duì)五葉草莓黃酮提取率的影響較?。?0-21］。

從圖6 可知，液料比和超聲溫度兩因素之間的響應(yīng)面坡度最陡，交互作用極顯著;液料比和超聲溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲溫度等兩因素之間的響應(yīng)面坡度陡峭且等高線(xiàn)趨于橢圓形，交互作用顯著;超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩因素之間響應(yīng)面坡度比較平坦，交互不顯著。上述結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)回歸模型最優(yōu)組合分析，優(yōu)化的提取工藝參數(shù)為:液料比12 ∶1(mL/g) 、超聲時(shí)間27 min、超聲溫度59 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)61%，其五葉草莓總黃酮提取率預(yù)測(cè)值為10.80 mg/g。以上述最優(yōu)工藝組合進(jìn)行五葉草莓黃酮提取，實(shí)際測(cè)得的黃酮提取率為10.68 mg/g，與模型理論預(yù)測(cè)值(10.80 mg/g) 之間的相對(duì)誤差僅為1.12%，說(shuō)明采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的五葉草莓黃酮提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際生產(chǎn)。

圖6 各因素交互作用對(duì)黃酮提取率的影響

3 結(jié) 論

以野生五葉草莓為研究對(duì)象，采用Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化五葉草莓總黃酮的提取工藝，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):

(1) 五葉草莓總黃酮的最佳提取工藝為: 液料比12∶1(mL/g) 、超聲時(shí)間27 min、超聲溫度59 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)61%。

(2 在最佳提取工藝條件下，五葉草莓總黃酮提取率實(shí)際可達(dá)10.68 mg/g，而傳統(tǒng)水浴回流法提取普通草莓黃酮的得率為5.13 mg/g［22］，說(shuō)明超聲波輔助醇提法提取得率為傳統(tǒng)法的2.1 倍，且該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。研究結(jié)果可為五葉草莓總黃酮物質(zhì)的深度開(kāi)發(fā)利用提供參考。