伍娜娜，榮 娜，康 超，劉 祥，陳 琛，陳春琳，丁 銳，吳三橋

(1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001；2.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是一種條件致病菌[1]，也是一種人畜共患病原菌，可誘發(fā)人類腹瀉、膀胱炎、敗血癥、膽囊炎、嬰兒腦膜炎及養(yǎng)殖動(dòng)物的乳房炎，尤其是奶牛和奶山羊乳房炎，給奶制品業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。目前，抗生素是防治大腸桿菌感染的主要化學(xué)藥物。然而，抗生素的濫用難免會(huì)造成細(xì)菌耐藥性、藥物殘留和環(huán)境污染，對(duì)人和動(dòng)物腸道菌群微生態(tài)平衡產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，迫切需要深入研究其耐藥機(jī)制，并開發(fā)新型疫苗來防治大腸桿菌的感染[5]。外膜蛋白A(Outer membrane protein A，OmpA)是陰性桿菌重要的外膜蛋白，其表達(dá)豐度高，在生物膜形成、宿主細(xì)胞的識(shí)別與侵襲、多重耐藥等方面起著重要作用[6]。已有研究報(bào)道，OmpA是大腸桿菌感染發(fā)病機(jī)制中的主要毒力因子[7]，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸道和泌尿生殖系統(tǒng)等疾病[8]。OmpA具有較強(qiáng)的免疫原性[8]，能夠誘導(dǎo)宿主的先天和過繼免疫應(yīng)答[9]。VAIPHEI等[10]報(bào)道，OmpA可促進(jìn)細(xì)菌黏附到哺乳動(dòng)物細(xì)胞。HSIEH等[2]用特異性重組OmpA蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)OmpA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達(dá)，從而保護(hù)小鼠免受大腸桿菌腦內(nèi)感染引起的死亡。GUAN等[6]評(píng)估OmpA抗血清對(duì)大腸桿菌感染的潛在免疫保護(hù)作用，在小鼠模型中進(jìn)行了活性保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，重組OmpA蛋白接種的小鼠在大腸桿菌CVCC 1515攻擊時(shí)能夠受到良好的保護(hù)。RAINARD等[3]用純化的重組OmpA蛋白進(jìn)行免疫誘導(dǎo)，能夠使奶牛抗體效價(jià)雙對(duì)數(shù)增加，表明重組OmpA蛋白是誘導(dǎo)奶牛產(chǎn)生抗體的良好免疫原。GU等[1]通過對(duì)小鼠進(jìn)行免疫發(fā)現(xiàn)，OmpA特異性抗體能夠介導(dǎo)吞噬調(diào)理作用并抑制細(xì)菌入侵，從而給被大腸桿菌攻擊的小鼠預(yù)防性保護(hù)。目前，對(duì)大腸桿菌OmpA的致病和免疫作用已有一定了解，但仍未開發(fā)出預(yù)防大腸桿菌感染的候選疫苗。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大腸桿菌OmpA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化及理化性質(zhì)分析，并從疫苗的研制方向——表位疫苗角度，采用表位疫苗設(shè)計(jì)方法獲得重組優(yōu)勢(shì)表位多肽，進(jìn)一步提高大腸桿菌OmpA免疫效果，為大腸桿菌OmpA表位疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取由NCBI數(shù)據(jù)庫公布的大腸桿菌外膜蛋白OmpA序列(登錄號(hào)NP_415477.1)，共含346個(gè)氨基酸，序列如下：MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINNNGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKAQGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVFAGGVEYAITPEIATRLEYQWTNNIGDAHTIGTRPDNGMLSLGVSYRFGQGEAAPVVAPAPAPAPEVQTKHFTLKSDVLFNFNKATLKPEGQAALDQLYSQLSNLDPKDGSVVVLGYTDRIGSDAYNQGLSERRAQSVVDYLISKGIPADKISARGMGESNPVTGNTCDNVKQRAALIDCLAPDRRVEIEVKGIKDVVTQPQA。

1.2 方法

1.2.1 進(jìn)化關(guān)系預(yù)測(cè) 通過DNAMAN 8.0將NCBI數(shù)據(jù)庫中不同菌株OmpA的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA 5.0對(duì)不同菌株的OmpA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 采用ExPASy-ProtParam預(yù)測(cè)分析OmpA蛋白的親水性、等電點(diǎn)、半衰期、穩(wěn)定性，從ProtScale Analysis數(shù)據(jù)庫獲得OmpA蛋白的親水性圖譜。

1.2.3 信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用Signal P 4.1軟件預(yù)測(cè)OmpA的信號(hào)肽，利用TMHMM Serverv.2.0進(jìn)行OmpA的跨膜結(jié)構(gòu)分析。應(yīng)用SOPMA和SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)軟件，分別對(duì)OmpA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 采用生物信息學(xué)String軟件對(duì)OmpA與其他蛋白質(zhì)的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞表位預(yù)測(cè) 分別采取BepiPred 1.0和ABCpred共2種方案對(duì)OmpA的B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得其優(yōu)勢(shì)肽段。利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法CTLpred和MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽在線預(yù)測(cè)程序Peptide對(duì)CTL細(xì)胞抗原表位和Th細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.6 串聯(lián)表位重組分析 為了選出抗原性較好的組合，并將其作為多表位疫苗的最優(yōu)氨基酸序列，將獲得的3種抗原表位中的優(yōu)勢(shì)表位依次進(jìn)行編號(hào)，在相鄰細(xì)胞表位間用甘氨酸(GGGG)進(jìn)行拼接，再利用DNASTAR.Lasergene.v 7.1對(duì)獲得的表位肽段進(jìn)行不同排序優(yōu)化，將最優(yōu)組合翻譯為核苷酸序列，獲得最終的重組表位多肽。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌OmpA的同源性與系統(tǒng)發(fā)生分析

通過DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行不同菌株OmpA的氨基酸序列同源性分析可知，不同菌屬間OmpA的氨基酸序列同源性較差(圖1)。采取MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示，大腸桿菌與阪崎腸桿菌、腸炎沙門氏菌間進(jìn)化關(guān)系較近，OmpA免疫動(dòng)物產(chǎn)生的特異性與非特異性抗體，可能為不同種腸道細(xì)菌的感染提供交叉免疫保護(hù)作用。

圖1 OmpA氨基酸序列的多重比對(duì)Fig.1 Multiple alignment of amino acid sequences of OmpA

2.2 大腸桿菌OmpA理化性質(zhì)分析

由OmpA理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果可知，OmpA分子質(zhì)量為37.2 ku，理論等電點(diǎn)為5.99，脂肪指數(shù)為77.28；不穩(wěn)定指數(shù)為21.44，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)；OmpA的分子式為C1 652H2 565N455O509S8；半衰期大于10 h；OmpA的平均親水性為-0.339，氨基酸分值最小為-2.600，最大為2.889，表明其為親水性蛋白質(zhì)(圖3)。

2.3 大腸桿菌OmpA的信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由OmpA信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果可知，該蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列由N端的21個(gè)氨基酸殘基組成，切割位點(diǎn)在21—22個(gè)氨基酸殘基之間(圖4)。由OmpA跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可知，7—29位氨基酸間形成一個(gè)可信度較高的跨膜結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖2 OmpA氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 大腸桿菌OmpA的親水性預(yù)測(cè)

圖4 大腸桿菌OmpA的信號(hào)肽分析

圖5 大腸桿菌OmpA跨膜區(qū)分析Fig.5 Transmembrane domain prediction of Escherichia coli OmpA

2.4 大腸桿菌OmpA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

SOPMA軟件分析OmpA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可信度為82.00%，α-螺旋占比例為31.79%、β-轉(zhuǎn)角占6.36%、β-片層和無規(guī)則卷曲分別占16.18%和45.66%(圖6)，無規(guī)則卷曲處存在抗原表位的可能性較大，為細(xì)胞抗原表位的產(chǎn)生奠定了一定基礎(chǔ)。使用SWISS-MODEL在線預(yù)測(cè)軟件模擬,OmpA的三維空間結(jié)構(gòu)為桶狀結(jié)構(gòu)(圖7)。

2.5 大腸桿菌OmpA的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過String方法預(yù)測(cè)大腸桿菌OmpA的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)可知，大腸桿菌OmpA與10種蛋白質(zhì)存在相互作用，其中par和coa這2種蛋白質(zhì)與OmpA的作用相對(duì)更緊密(圖8)。

c:無規(guī)則卷曲; e:β-片層; h:α-螺旋; t:β-轉(zhuǎn)角

圖7 大腸桿菌OmpA的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of tertiary structure of Escherichia coli OmpA

2.6 大腸桿菌OmpA的B細(xì)胞表位分析

通過ABCpred和BepiPred 1.0共2種方法預(yù)測(cè)OmpA的B細(xì)胞表位可知，獲得B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位有4段，分別為第44—50位、第83—95位、第126—135位、第298—313位(表1和表2)。

圖8 大腸桿菌OmpA的蛋白質(zhì)互作預(yù)測(cè)Fig.8 Protein-protein interaction prediction of Escherichia coli OmpA

表1 ABCpred預(yù)測(cè)的大腸桿菌OmpA的B細(xì)胞表位肽段位置

表2 BepiPred 1.0預(yù)測(cè)的大腸桿菌OmpA的B細(xì)胞表位肽段位置Tab.2 Prediction of B cell epitopes of Escherichia coli OmpA by BepiPred 1.0 method

2.7 大腸桿菌OmpA的T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

2.7.1 大腸桿菌OmpA的CTL細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法CTLpred對(duì)OmpA的CTL細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取5種不同結(jié)合肽類型，綜合相同抗原表位序列，分析得到OmpA的CTL細(xì)胞抗原表位為第237—245位的ALDQLYSQL(表3)。

表3 大腸桿菌OmpA的CTL細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)Tab.3 The CTL epitopes prediction of Escherichia coli OmpA

2.7.2 大腸桿菌OmpA的Th細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè) 采用Peptide預(yù)測(cè)OmpA的Th細(xì)胞抗原表位，選用3種不同多肽類型，根據(jù)共有肽段，得到第284—292位的YLISKGIPA為OmpA的Th細(xì)胞抗原表位(表4)。

表4 大腸桿菌OmpA的Th細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)Tab.4 The Th epitopes prediction of Escherichia coli OmpA

2.8 大腸桿菌OmpA重組串聯(lián)抗原表位分子設(shè)計(jì)

為得到大腸桿菌OmpA序列抗原性較好的串聯(lián)表位，將獲得的B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行編號(hào)，用甘氨酸(GGGG)作為2個(gè)相鄰表位間的柔性片段，然后用DNASTAR.Lasergene.v 7.1軟件將B細(xì)胞抗原表位編號(hào)為1—4，CTL細(xì)胞抗原表位編號(hào)為5，Th細(xì)胞抗原表位編號(hào)為6，分析不同排列組合并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，選取最佳順序：5—4—1—6—3—2(圖9)。轉(zhuǎn)化成氨基酸序列：ALDQLYSQLGGGGRGMGESNPVTGNTCDNGGGGFINNNGPGGGGYLISKGIPAGGGGDTKSNVYGKNGGGGPYKGSVENGAYKA(下劃線為柔性片段)。翻譯成核苷酸序列：GTCGTCAGTGATTGGGTAACCCAGTTTGGTGGCGGTGGCCGGGCCATTGTTGTTGATGAAACCAGTGTCATGGTACTGGGACCAGCCGGTGGCGGTGGCGTTGGATTCGCCCATACCACGGGTGGCGGTGGCGTAACCACCAAAAGCACCAGCGCCCAGGGTGGCGGTGGCCAGAACGTCAGACTTCAGAGTGAAGTGCTTGGTGGCGGTGGCACCGATGCGGTCGGTGTAACCCAGAACAACTACGGAACC(下劃線為柔性片段核苷酸序列)。

圖9 大腸桿菌OmpA重組多肽抗原指數(shù)分析Fig.9 Antigenic index of Escherichia coli OmpA recombination polypeptide

3 結(jié)論與討論

生物信息學(xué)分析目前在基因序列比對(duì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析方面應(yīng)用較多，它能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的抗原表位，并降低試驗(yàn)盲目性，提高工作效率，在疫苗研制方面應(yīng)用廣泛[11-12]。

本研究采用生物信息學(xué)分析方法對(duì)大腸桿菌OmpA進(jìn)行蛋白質(zhì)互作關(guān)系、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，有跨膜結(jié)構(gòu)，存在信號(hào)肽序列。大腸桿菌OmpA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無規(guī)則卷曲為主(45.66%)，而無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)易形成盤旋、扭曲，暴露在蛋白質(zhì)外層，成為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞抗原表位的可能性較大，為抗原表位的產(chǎn)生打下基礎(chǔ)[11,13]。

抗原表位根據(jù)受體差異可分為B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位。近年來發(fā)展出多種預(yù)測(cè)方法，例如機(jī)器學(xué)習(xí)算法，它主要包括支持向量機(jī)器(SVMHC)、隱馬爾可夫模型(HMM)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等，隨后也相繼出現(xiàn)了計(jì)算機(jī)軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(基于矩陣方法和基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)方法)等方法來預(yù)測(cè)細(xì)胞表位[14]。依據(jù)蛋白質(zhì)B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)計(jì)算方法，開發(fā)出的一些在線預(yù)測(cè)軟件使用便捷，預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。常用的B細(xì)胞抗原表位在線預(yù)測(cè)方法有DNASTAR、PREDITOP、PEOPLE、BEPITOPE、COBEpro、BepiPred和ABCpred等[11,14-15]。其中，BepiPred主要進(jìn)行線性表位的預(yù)測(cè)[11]，而ABCpred的預(yù)測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率較高[16]。同時(shí)使用這2種方法，能夠進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，因此，本研究選擇這2種方案對(duì)OmpA的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，最終獲得OmpA的B細(xì)胞抗原表位肽段的位置為第44—50位、第83—95位、第126—135位、第298—313位。

CTL細(xì)胞抗原表位是抗原中能與MHC-Ⅰ類分子結(jié)合后激活CTL細(xì)胞免疫的短肽，常見的預(yù)測(cè)方法包含IEDB、SYFPEITHI、SYFPEPI、BIMAS、IMTECH、CTLpred、NetCTL和NetMHC等，在腫瘤、病毒、細(xì)菌和寄生蟲的CTL細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)上均有應(yīng)用[14-18]。劉娜等[15]采取SYFPEPI、BIMAS和NetCTL方法分析結(jié)核分枝桿菌α晶體蛋白(Rv2031c)，獲得3個(gè)優(yōu)勢(shì)CTL細(xì)胞抗原表位，這些表位可能激起機(jī)體對(duì)病原菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)；劉祥等[16]利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與量化矩陣法預(yù)測(cè)，GP5、CAP與E2蛋白各具有1個(gè)CTL細(xì)胞抗原表位，這對(duì)蛋白質(zhì)優(yōu)勢(shì)抗原表位的篩選有重要意義。本研究采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法對(duì)OmpA的CTL細(xì)胞抗原表位分析，結(jié)果得到該蛋白質(zhì)的CTL細(xì)胞抗原表位為第237—245位的ALDQLYSQL。

Th細(xì)胞抗原表位是抗原中能與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，并經(jīng)抗原呈遞后可激活機(jī)體免疫反應(yīng)的短肽，該表位預(yù)測(cè)在細(xì)菌蛋白質(zhì)和病毒蛋白質(zhì)上均有研究[16-17]。于娟等[18]用SYFPEITHI軟件預(yù)測(cè)H9N2禽流感病毒的HA蛋白中含有6個(gè)Th細(xì)胞抗原表位，推測(cè)其可能誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫。本研究通過選取3類不同等位基因的Th細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析，獲得OmpA的Th細(xì)胞抗原表位區(qū)段為第284—292位的YLISKGIPA，這為串聯(lián)表位疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

表位疫苗是一種可同時(shí)攜帶多個(gè)抗原表位及輔助性表位的疫苗，安全性好、易操作且可控[19]，在口蹄疫病毒[20]、乙型腦炎病毒[13]、幽門螺旋桿菌[21]、埃博拉病毒[22]及人類免疫缺陷病毒1型[23]等病原菌上均有報(bào)道。本研究預(yù)測(cè)，大腸桿菌OmpA可能有4個(gè)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位、1個(gè)CTL細(xì)胞抗原表位、1個(gè)Th細(xì)胞抗原表位，并重組獲得了抗原性較好的重組多肽，為OmpA蛋白表位疫苗的開發(fā)提供了依據(jù)。