樊祖清，李紅麗，蘆阿虔，王 巖，段宏群，程仲記

(1.鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450001； 2.河南省洛陽市煙草公司，河南 洛陽 471000； 3.中國煙草總公司河南省公司，河南 鄭州 450000)

由于長期連作、施用化肥和農藥，煙草土傳病害如黑脛病、根結線蟲病等發(fā)生越來越重，且危害面積越來越大。黑脛病(The black shank)是煙草種植過程中普遍發(fā)生的一種土傳性真菌病害[1]。根結線蟲(Meloidogyne)是一種雜食性植物病原線蟲，寄主范圍廣泛，包括茄果類、豆類及蘿卜等蔬菜，還可傳播真菌和細菌性病害，主要危害作物根部，致使作物結果少、產量低，嚴重的會造成植株提早死亡[2-5]。在河南省煙葉種植區(qū)，煙草土傳病害主要是黑脛病和根結線蟲病。前者易發(fā)生在高溫高濕環(huán)境下，后者主要在干旱條件下發(fā)生。土傳病害發(fā)生的最直接表現(xiàn)是土壤微生物中病原微生物增多，微生態(tài)失衡[6-7]。因此，安全高效地減少土壤中病原微生物、改善土壤微生態(tài)結構是解決土傳病害發(fā)生的一項重要措施。

石灰氮作為肥料使用已有超過百年的歷史，由于其本身以及轉化過程的中間產物和最終產物都會對作物產生毒害作用，曾一度難以推廣[8]。然而，隨著技術的革新和研究的深入，石灰氮作為一種肥藥兩用的土壤凈化劑再一次進入農業(yè)使用范圍[9]。石灰氮在土壤中與水發(fā)生反應，生成了氫氧化鈣和氰氨，氰氨水解形成尿素，最終分解成氨，直接被植物吸收[10]。早在20世紀90年代末，朱本岳等[11]研究了石灰氮對大白菜根腫病的防治效果。近年來，侯茂林[12]、劉志明等[13]和許華等[14]等研究證實，石灰氮對瓜果蔬菜的根結線蟲病具有很好的防治效果，對土壤的理化性狀也有很大影響。這些試驗探究了石灰氮對土傳病害的防治效應，但對其降低土傳病害發(fā)生的具體原因并未做出研究。鑒于此，在煙草種植起壟階段(移栽前)向煙田中施加石灰氮，并采用薄膜覆蓋，通過與常規(guī)施肥對比，研究施用石灰氮對煙株生長過程及煙株根際土壤微生物區(qū)系的影響，為煙草土傳病害的有效防控和煙草生產中石灰氮的施用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗選擇在洛陽市宜陽縣黑脛病和根結線蟲病多發(fā)的鹽鎮(zhèn)鄉(xiāng)煙葉種植區(qū)進行。該地塊連續(xù)3 a植煙，土壤為紅黏土。有機質含量23.06 g/kg，全氮含量1.25 g/kg，堿解氮含量70.01 mg/kg，有效磷含量36.36 mg/kg，速效鉀含量188.88 mg/kg，pH值為6.96。供試烤煙品種為豫煙6號。

1.2 試驗設計

試驗設置處理(T)和對照(C)。處理T煙田的氮源由石灰氮提供，石灰氮用量為150 kg/hm2，在煙草移栽前25 d條施，澆水后覆蓋地膜；對照C煙田正常施肥。處理T與對照C煙田施用的氮(N)、磷(P2O5)、鉀(K2O)量均分別為45、90、135 kg/hm2。

1.3 樣品采集、測定項目及方法

1.3.1 樣品采集 在煙草移栽前(施用石灰氮之前)、團棵期、旺長期和成熟期按5點法采集煙株根際土樣。土壤樣品預處理：取一部分新鮮土壤裝離心管后冷凍保存以備進行土壤微生物基因測序；另取一部分置于4 ℃冰箱冷藏以備檢測實驗室可培養(yǎng)微生物數(shù)量。

1.3.2 可培養(yǎng)微生物數(shù)量 土壤微生物數(shù)量采用涂布平板法測定，細菌、真菌、放線菌數(shù)量分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基進行測定[15]。為了更好地比較不同時期的土壤微生物數(shù)量，在計算時去除土壤中的水分，以干土表示。

1.3.3 宏基因組微生物測序 土壤冷凍樣品寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行宏基因組微生物(包括細菌和真菌)測序，由于放線菌門隸屬于細菌界，故宏基因組不單獨測定放線菌門。測序結果用Alpha多樣性、細菌(真菌)群落結構、Betta多樣性表示[16]。

1.3.4 煙株農藝性狀、病害發(fā)生情況 團棵期和旺長期測定煙株的有效葉數(shù)、株高、莖圍以及腰葉大小，成熟期調查烤煙黑脛病和根結線蟲病的發(fā)病率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007和SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 施用石灰氮對煙株根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

由表1可知，從移栽前到團棵期，處理T煙株根際土壤細菌數(shù)量減少87.0%，真菌數(shù)量減少89.8%，放線菌數(shù)量減少87.3%，這是由于石灰氮具有殺菌效果，殺滅了處理T煙田土壤中的大多數(shù)微生物；從團棵期到旺長期，處理T煙株根際土壤細菌和放線菌的數(shù)量分別增加171.9%、83.3%，真菌數(shù)量減少5.2%；從旺長期到成熟期，根際土壤細菌、真菌和放線菌微生物的數(shù)量分別減少了52.9%、77.2%、56.8%。

從移栽前到團棵期，對照C煙株根際土壤細菌數(shù)量減少4.9%，真菌數(shù)量減少82.1%，放線菌數(shù)量減少37.6%；從團棵期到旺長期，煙株根際土壤細菌和真菌的數(shù)量分別減少39.6%、36.6%，放線菌數(shù)量增加30.5%。從旺長期到成熟期，根際土壤細菌、真菌、放線菌的數(shù)量分別減少了73.9%、8.0%、18.2%。

團棵期和旺長期，對照C的細菌數(shù)量顯著高于處理T；團棵期—成熟期，對照C的放線菌數(shù)量均顯著高于處理T。這可能是處理T石灰氮的殺菌和毒害作用致使土壤中細菌和放線菌大量死亡所致。移栽前、團棵期、旺長期，處理T與對照C煙株根際土壤真菌數(shù)量沒有顯著差異，成熟期則表現(xiàn)為處理T顯著低于對照C。該煙區(qū)土傳病害以真菌型病害為主[17]，真菌數(shù)量大量減少，一定程度上也減少了真菌病原菌的數(shù)量，從而可能有效降低煙草病蟲害的發(fā)生。

表1 施用石灰氮對煙株根際可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響Tab.1 Effects of application of lime nitrogen on the number of culturable microorganisms in rhizosphere soil of tobacco plants

注：不同小寫字母表示同種微生物同一處理不同生育時期差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示同種微生物同一時期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters indicated that the same microorganism had significant difference in different growth stages under the same treatment (P<0.05);Different uppercase letters indicated significant difference between the same microorganism and different treatments at the same stages(P<0.05).

2.2 施用石灰氮對煙株根際土壤微生物多樣性和群落結構變化的影響

2.2.1 Alpha多樣性變化 Alpha多樣性也稱為生境內物種多樣性，主要關注均勻生境下的物種數(shù)目，常利用Alpha多樣性中的OTU值、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Coverage對煙田根際土壤中微生物多樣性進行分析[17-18]。

根據(jù)表2所示，煙草生長過程測定的Coverage≥0.95，表明該數(shù)據(jù)可代表樣本的真實情況。處理T與對照C細菌的OTU值在煙草生長過程中呈先增加后減少，成熟期再次增加的趨勢，團棵期達到最大值；團棵期對照C的OTU值高于處理T，旺長期、成熟期表現(xiàn)與團棵期相反。處理T真菌OTU值隨著煙株的生長先增加后減少，團棵期達到最大；對照C真菌OTU值變化與細菌OTU值變化類似，團棵期和成熟期真菌OTU值均表現(xiàn)處理T低于對照C，旺長期則相反。細菌的Shannon指數(shù)隨著煙株生長整體表現(xiàn)為先減少后增加再減少的趨勢；處理T真菌Shannon指數(shù)變化趨勢與細菌類似，對照C真菌Shannon指數(shù)隨著煙株的生長表現(xiàn)為先減少后增加；處理T細菌和真菌的Shannon指數(shù)均在旺長期達到最大；對照C的細菌和真菌Shannon指數(shù)均在移栽前最大。處理T細菌的Chao1指數(shù)隨煙株生長逐漸減小，成熟期有所增加；對照C細菌的Chao1指數(shù)變化趨勢與OTU值變化趨勢一樣。處理T真菌的Chao1指數(shù)隨著煙株的生長先增加后減少，團棵期最高；對照C真菌的Chao1指數(shù)隨煙株生長過程先增加后減少，成熟期再次增加，團棵期最高。

表2 施用石灰氮后煙株根際土壤微生物Alpha多樣性變化

2.2.2 群落結構變化 將菌種分布頻率超過5%的細菌和真菌認定為優(yōu)勢菌門。由表3可知，在煙株生長過程中出現(xiàn)的優(yōu)勢細菌門有Proteobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Planctomycetes、Bacteroidetes。其中，Bacteroidetes僅在移栽前是優(yōu)勢菌門，Planctomycetes僅在團棵期為優(yōu)勢菌門，Gemmatimonadetes在旺長期和成熟期是優(yōu)勢菌門，其余4個細菌門在整個煙株生長過程中均為優(yōu)勢細菌門。隨著煙株生長，Proteobacteria和Acidobacteria分布頻率呈先降低后增加趨勢，Proteobacteria在成熟期分布頻率最高，Acidobacteria在移栽前分布頻率最高；Firmicutes和Actinobacteria分布頻率隨著煙株生長表現(xiàn)為先增加后降低，F(xiàn)irmicutes在團棵期分布頻率最高，Actinobacteria在旺長期分布頻率最高。Proteobacteria分布頻率在團棵期和旺長期均表現(xiàn)為處理T低于對照C，成熟期則表現(xiàn)為處理T高于對照C；Acidobacteria分布頻率在處理T與對照C之間的變化與Proteobacteria相反。Firmicutes分布頻率在整個煙株生長過程中均表現(xiàn)為處理T低于對照C；Actinobacteria分布頻率與Firmicutes相反?？梢?，施用石灰氮對大多數(shù)細菌門具有一定的影響，但隨著煙株的生長這種影響逐漸減弱。

表3 施用石灰氮后煙株根際土壤細菌門水平群落結構分布Tab.3 Horizontal community structure of Bacteriaphylum in tobacco rhizosphere after application of lime nitrogen %

注：編號8、12為尚未確定中文名稱的細菌門。

Note：Numbers 8 and 12 are the bacteriophytas whose Chinese name haven’t been determined.

由表4可知，在煙株生長過程中出現(xiàn)的優(yōu)勢真菌門有Ascomycota、Basidiomycota、Zygomycota、Chytridiomycota、Blastocladiomycota。其中Ascomycota和Basidiomycota在煙株整個生長過程中都是優(yōu)勢真菌門，Zygomycota在團棵期、旺長期和成熟期都是優(yōu)勢真菌門，Chytridiomycota在對照C成熟期為優(yōu)勢真菌門，Blastocladiomycota在處理T成熟期是優(yōu)勢真菌門。在煙株整個生長過程中，Ascomycota和Basidiomycota分布頻率隨著煙株生長逐漸降低，但對照C中Ascomycota的分布頻率在團棵期最高，處理T中Basidiomycota的分布頻率在團棵期最高。Zygomycota分布頻率隨著煙株生長逐漸升高，成熟期最高。Ascomycota分布頻率在整個煙株生長過程中都是處理T低于對照C；Basidiomycota分布頻率在團棵期和旺長期表現(xiàn)為處理T高于對照C，在成熟期則相反；Zygomycota分布頻率在團棵期表現(xiàn)為處理T低于對照C，旺長期和成熟期則相反。此外，真菌門水平的分布頻率變幅總體較大，表明煙株生長對根際土壤真菌的影響相對也較大。施用石灰氮處理煙田煙株根際土壤真菌分布頻率變化比對照C更大，表明施用石灰氮加劇了真菌分布頻率的變動，對真菌類病害發(fā)生會產生一定影響。另外，由試驗結果來看，施用石灰氮對煙株根際土壤真菌的影響大于對細菌的影響。

表4 施用石灰氮后煙株根際土壤真菌門水平群落結構分布Tab.4 Horizontal community structure of fungi phylum in tobacco rhizosphere after application of lime nitrogen %

注：編號7、8為尚未確定中文名稱的真菌門。

Note：Numbers 7 and 8 are the eumycotas whose Chinese name haven’t been determined.

2.2.3 Betta多樣性 PCA主成分分析能夠反映不同調控措施下煙株根際土壤微生物區(qū)系的變化情況，樣本相似度越高，在圖像中表現(xiàn)越聚集。圖1a為細菌PCA圖，移栽前與成熟期處理T、對照C的細菌群落聚集在一起，說明移栽前和成熟期的細菌群落結構相似度較高；團棵期和旺長期處理T與對照C的細菌群落聚集在一起，說明團棵期和旺長期的細菌群落相似度較高。移栽前和成熟期在一個象限，團棵期和旺長期在另一個象限，說明煙株生長過程中細菌群落結構發(fā)生了變化。圖1b是真菌的PCA圖，與圖1a的變化相似，只是各樣本間相對距離與圖1a相比產生了變化，表明施加石灰氮對根際土壤真菌群落結構影響程度大于對細菌群落結構的影響程度。

2.3 施用石灰氮對煙株農藝性狀的影響

由表5可知，團棵期煙株的株高、有效葉數(shù)、莖圍和腰葉大小均表現(xiàn)為處理T高于對照C，且處理T煙株株高顯著高于對照C；旺長期，處理T與對照C的有效葉數(shù)和莖圍差異不大，但對照C的株高和腰葉大小明顯大于處理T。

圖1 施用石灰氮后煙田土壤微生物PCA圖Fig.1 PCA map of soil microorganisms in tobacco field after application of lime nitrogen

Tobacco growth stageTreatment/Effective number of leaves/cmPlant height/cmStem girth×/(cm×cm)Waist length×widthT11.00±1.58a21.30±3.03a8.70±0.55a42.00×30.00Rosette stageC10.00±1.00a15.00±6.93b7.63±0.90a36.00×24.33T21.00±2.83a80.00±4.24b9.75±0.35a40.50×23.00Vigorous growth stageC22.67±2.08a96.33±10.97a10.17±0.29a48.00×29.00

注：同列不同小寫字母表示不同生育時期不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercase letters in the same column indicate significant differences between different treatments at the same growth stage (P<0.05).

2.4 施用石灰氮對煙株病害發(fā)生情況的影響

從表6可以看出，處理T煙株根結線蟲病的發(fā)病率僅為對照C的1/2，黑脛病的發(fā)病率顯著低于對照C，說明施用石灰氮對根結線蟲病和黑脛病均具有一定的防控作用。

表6 施用石灰氮對烤煙病害發(fā)生的影響Tab.6 Effects of lime nitrogen application on the incidence of flue-cured tobacco %

注：同列不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)。

Note：The incidence of flue-cured tobacco under different treatments was significantly different(P<0.05).

3 結論與討論

石灰氮可以有效改良土壤和降低土傳病害發(fā)生率，提高作物品質和產量[18]。但由于土壤微生態(tài)環(huán)境復雜且處于不斷變化過程中，石灰氮的分解一般需要8～10 d，為了使石灰氮充分發(fā)揮效應，作物的根系又不受損害，一般在種植作物的前25～30 d施用石灰氮[19]。

本試驗結果表明，從移栽前到團棵期，施用石灰氮的煙田煙株根際土壤細菌、真菌和放線菌數(shù)量較對照分別降低了87.0%、89.8%、87.3%，說明施用石灰氮可以顯著減少根際土壤微生物的數(shù)量；對照除了真菌數(shù)量顯著降低82.1%，細菌和放線菌數(shù)量變化相對較小，表明隨著煙株生長，根際土壤細菌和放線菌數(shù)量變化不明顯，真菌數(shù)量變化顯著。成熟期，處理T和對照C的細菌數(shù)量差異不大，真菌和放線菌數(shù)量均表現(xiàn)對照C顯著高于處理T?？梢?，施用石灰氮對煙株根際土壤微生物的殺滅作用具有廣泛性，但隨著石灰氮的分解以及煙株的生長，煙株根際土壤微生物的數(shù)量逐漸恢復。煙田土壤微生物PCA主成分分析顯示，施用石灰氮可以改變根際土壤微生物的群落結構，且對真菌群落結構的影響大于對細菌群落結構的影響。煙株農藝性狀結果顯示，施用石灰氮后煙株生長前期(團棵期)各指標均優(yōu)于對照C，且株高差異顯著；在煙株生長中后期(旺長期)則表現(xiàn)為低于對照C，株高差異顯著。這可能是由于施用石灰氮后土壤理化性狀如pH值、氮轉化等變化對煙株生長產生了一定影響。此外，施用石灰氮可以顯著降低煙草根結線蟲病和黑脛病的發(fā)病率。

由于施用石灰氮對煙株根際微生物的殺滅作用具有廣泛性，在殺滅病原菌的同時也會殺滅益生菌，今后可考慮在施用石灰氮一段時間后如團棵期或旺長期，在土壤中施加益生菌，但這是否會影響烤煙的產量和品質需要后續(xù)的相關研究。