王俊芳，王 淼

(河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475004)

細(xì)菌在細(xì)胞低密度狀態(tài)下所產(chǎn)生的信號(hào)分子會(huì)很快地?cái)U(kuò)散；其在高度密集狀態(tài)下所產(chǎn)生的信號(hào)分子可以積聚到較高的濃度，該狀態(tài)下的菌體細(xì)胞能感應(yīng)自身所產(chǎn)生的信號(hào)分子，從而做出相應(yīng)的協(xié)調(diào)反應(yīng)[1]。如：協(xié)調(diào)菌體的群集運(yùn)動(dòng)、感受態(tài)的形成、抗生素的合成、γ-聚谷氨酸的合成、生物膜的形成和致病基因的表達(dá)等細(xì)胞行為。這種對(duì)群體密度刺激做出反應(yīng)的基因調(diào)控系統(tǒng)稱為群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)系統(tǒng)[2-5]。對(duì)近年來枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中感受態(tài)調(diào)控系統(tǒng)ComQXPA(Com是compotence的縮寫)的組成、系統(tǒng)在菌體生長繁殖過程中的重要調(diào)控機(jī)制、枯草芽孢桿菌作為生防菌在農(nóng)業(yè)方面應(yīng)用的作用機(jī)制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并針對(duì)其ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用，提出了該系統(tǒng)在生防方面的潛在應(yīng)用方向。

1 枯草芽孢桿菌ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的組成

枯草芽孢桿菌中ComQXPA調(diào)控系統(tǒng)是菌體的一個(gè)重要的QS系統(tǒng)。該系統(tǒng)由comX、comQ、comP和comA等4個(gè)調(diào)控基因組成，基因的名稱是根據(jù)它們?cè)谙到y(tǒng)中的功能命名，研究顯示，4個(gè)基因中任何1個(gè)的突變都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞感受態(tài)的降低[6]。comX編碼含有55個(gè)氨基酸殘基的Pre-ComX前導(dǎo)肽，Pre-ComX 再經(jīng)comQ基因的編碼產(chǎn)物異戊二烯轉(zhuǎn)化酶ComQ的修飾處理，產(chǎn)生由其C末端10個(gè)氨基酸殘基組成、具有活性的類異戊二烯類多肽信息素ComX[7]；細(xì)胞通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將信息素ComX釋放至胞外，其濃度隨細(xì)胞生長增殖而在胞外逐漸積聚，達(dá)到一定閾值時(shí)，與一種由comP編碼的跨膜信號(hào)蛋白，又稱為群體信號(hào)傳感器——一種組氨酸激酶(Histidine sensor kinase)ComP結(jié)合，激活該酶，促進(jìn)其自我磷酸化；磷酸化的ComP(以ComP～P表示)又將磷酸根轉(zhuǎn)移到由comA基因編碼的應(yīng)答調(diào)節(jié)因子(Response regulator)ComA的天冬氨酸殘基上，磷酸化的ComA (以ComA～P表示)被激活；ComA～P又可激活相關(guān)下游目標(biāo)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境變化。研究發(fā)現(xiàn)，comX、comP和comA影響相同系列基因的表達(dá)，說明激酶ComP只是信號(hào)分子ComX的接收器，而ComA是被ComP直接激活的轉(zhuǎn)錄因子，comQ只對(duì)ComX前體物Pre-ComX的修飾起作用。ComX、ComP和ComA組成一個(gè)專有的調(diào)控路徑，該路徑中信息素和激酶僅調(diào)控受ComA影響的基因[8-10]。

由phr基因家族中phrC基因編碼的5個(gè)氨基酸的多肽CSF (Competence and sporulation factor，感受態(tài)和孢子形成因子，也稱為外信息素C，phrC)也是參與調(diào)節(jié)ComA磷酸化的信號(hào)分子。由孢子形成早期有關(guān)的基因spoOH所編碼的σH因子參與啟動(dòng)phrC的轉(zhuǎn)錄，CSF蛋白前體物Pre-CSF的合成還在轉(zhuǎn)錄水平上受到孢子早期形成基因spoOA和abrB的調(diào)節(jié)。胞內(nèi)合成的Pre-CSF通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)被分泌到胞外并轉(zhuǎn)變成有活性的形式CSF[11]。胞外CSF在寡肽通透酶(Oligopeptide permease, Opp)的作用下被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。CSF在群體感應(yīng)過程中的作用與其在胞內(nèi)的濃度密切相關(guān)。當(dāng)胞內(nèi)濃度較低時(shí)，CSF可促進(jìn)感受態(tài)的發(fā)展，其與磷酸酶RapC結(jié)合并抑制其活性，從而降低RapC對(duì)ComA～P的脫磷酸化作用，以維持ComA～P的活性狀態(tài)，保證srfA操縱子的持續(xù)轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)相關(guān)基因感受態(tài)的發(fā)展。因此，在ComX和CSF這2種信息素的共同作用下，通過一個(gè)多級(jí)的信號(hào)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的作用激活晚期感受態(tài)基因的表達(dá)。CSF在孢子形成的早期起著信號(hào)肽的作用而參與孢子形成的調(diào)節(jié)，隨著環(huán)境條件的惡化，細(xì)菌生長營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，胞內(nèi)CSF濃度升高達(dá)到一定閾值時(shí)，促進(jìn)菌體進(jìn)入孢子形成階段[12]。

2 枯草芽孢桿菌ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)功能

枯草芽孢桿菌中ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控多個(gè)細(xì)胞行為，包括菌體感受態(tài)形成、生物膜的形成、胞外降解酶產(chǎn)生、抗生素和胞外多糖的產(chǎn)生、脂肪酸的代謝和運(yùn)輸?shù)刃袨椤?/p>

2.1 感受態(tài)的形成

細(xì)菌的感受態(tài)是指該狀態(tài)下其具有遺傳轉(zhuǎn)化的能力，即細(xì)胞能夠吸附、吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)?？莶菅挎邨U菌comS基因是ComQXPA系統(tǒng)中群體感應(yīng)與感受態(tài)之間直接相聯(lián)系的唯一基因，為嵌入在srfA操縱子上的一個(gè)小基因，是積累感受態(tài)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子Comk(由comk基因編碼)所必需的；蛋白接收器MecA(由mecA基因編碼)與Comk蛋白結(jié)合后，形成的復(fù)合物被ClpC-P蛋白酶降解。磷酸化的ComA～P和srfA操縱子結(jié)合，激活srfA操縱子的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)包括comS基因的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生ComS蛋白，該蛋白質(zhì)能與蛋白接收器MecA結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)，避免MecA與Comk結(jié)合，阻止感受態(tài)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子Comk被ClpC-P蛋白酶降解；Comk激活自身基因comk、comE操縱子及相關(guān)下游基因的表達(dá)而誘導(dǎo)感受態(tài)的形成[13]。

2.2 抗生素的產(chǎn)生

據(jù)報(bào)道，枯草芽孢桿菌中受ComA調(diào)控的操縱子的表達(dá)至少涉及5種胞外抗性物質(zhì)(TasA、bacillomycin D、Surfactins、Sublancin、Sporulation killing factor)的產(chǎn)生，這些抗性物質(zhì)分別是tasA、bmyA、srfA、sunA、skfA等操縱子的產(chǎn)物，具有多種生物活性，包括具有殺死枯草芽孢桿菌其他菌株細(xì)胞和其他種類細(xì)菌的能力[14-16]。其中，Surfactins是環(huán)7肽的β-羥基脂肪酸，由srfA操縱子轉(zhuǎn)錄合成，有關(guān)基因srfA-A、comA(srfA-B)和srfA-C編碼E1A、E1B和E2等3個(gè)單體合成酶，催化表面活性劑中氨基酸殘基的連接。srfA-A與comA相隔，ComA激活srfA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，SrfA-C負(fù)責(zé)將羥基脂肪酸轉(zhuǎn)移到SrfA-A蛋白上。另外，還有1個(gè)受ComA調(diào)控的基因yfmH，其編碼產(chǎn)物是一種陽離子肽類抗菌性物質(zhì)，該抗性物質(zhì)在營養(yǎng)物質(zhì)有限的環(huán)境條件下，降低敏感細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競爭能力，從而為枯草芽孢桿菌的生長提供充足的營養(yǎng)[17-19]。

2.3 菌體群集運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成

ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)參與調(diào)控枯草芽孢桿菌細(xì)胞的群集運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成。受ComA直接調(diào)控的srfA操縱子是菌體產(chǎn)生脂肽類抗生素所必需的，其產(chǎn)生的脂肽類抗生素除了具有抑菌活性和表面活性，還有助于生物膜和子實(shí)體的形成及群體運(yùn)動(dòng)[20-22]。研究顯示，yve操縱子的一些基因是生物膜形成所必需的[23]，yve操縱子受comA的間接調(diào)控，其基因編碼產(chǎn)物涉及菌體胞外多糖的產(chǎn)生。comP對(duì)菌體群集運(yùn)動(dòng)中相關(guān)的一些基因起調(diào)控作用[24-25]。

在其他類型菌體中，表面活性劑和胞外多糖也有助于菌體細(xì)胞的群集運(yùn)動(dòng)和生物膜的形成。對(duì)于革蘭氏陰性菌和陽性菌，它們的群體感應(yīng)雖然是不同的分子機(jī)制調(diào)控的，但它們產(chǎn)生表面活性劑和胞外多糖所需要表達(dá)的基因都受其群體感應(yīng)路徑所調(diào)控[26]。

2.4 胞外降解酶的產(chǎn)生

ComA作為一種調(diào)節(jié)子，參與調(diào)節(jié)一些與晚期生長有關(guān)的基因如degQ、rapA和rapC的表達(dá)。ComA正調(diào)控degQ，后者是枯草芽孢桿菌的多效性調(diào)控基因，其編碼產(chǎn)物DegQ參與調(diào)控細(xì)胞降解酶(果聚糖酶、堿性金屬蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶等)的產(chǎn)生和分泌。rapA和rapC編碼與感受態(tài)和孢子形成控制有關(guān)的磷酸酶。許多菌體胞外降解酶的產(chǎn)生受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[27]?？赡荏w現(xiàn)在，積累大量的胞外酶，以降解足夠的聚合物，供給菌體所需營養(yǎng)。Pel基因受ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)直接調(diào)控，其編碼果膠酸鹽裂解酶，表達(dá)量隨菌體密度增大而增加。果膠酸鹽裂解酶可降解植物組織成分，在革蘭氏陰性菌和其他革蘭氏陽性菌中果膠酸鹽裂解酶的產(chǎn)生也受群體感應(yīng)的調(diào)控。另外，不同類型細(xì)菌產(chǎn)生的涉及菌體—植物互作的產(chǎn)物，也受其群體感應(yīng)的調(diào)控[28-29]。

2.5 運(yùn)輸和分泌

幾個(gè)編碼運(yùn)輸器蛋白的基因都受ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。這些編碼運(yùn)輸器蛋白和涉及抗生素合成的基因是共轉(zhuǎn)錄的,如：編碼輸出功能的基因skfEFGH(ybdABDE基因也是編碼輸出功能的基因)與涉及編碼合成抗生素物質(zhì)的基因skfABCD(ybcOPST)共轉(zhuǎn)錄；編碼運(yùn)輸器的基因ycxA受srfA操縱子上游基因的連續(xù)轉(zhuǎn)錄所影響；還發(fā)現(xiàn)1個(gè)操縱子上的sipW基因是編碼信號(hào)肽酶的基因，該基因與1個(gè)產(chǎn)生抗性物質(zhì)所必需的基因tasA共轉(zhuǎn)錄[30]。另外，TasA有助于生物膜的形成。由于運(yùn)輸功能基因與生物合成功能基因共轉(zhuǎn)錄，編碼相應(yīng)物質(zhì)合成的功能基因也受ComQXPA群體感應(yīng)系統(tǒng)所調(diào)控[31-32]。

2.6 脂肪酸代謝

涉及脂肪酸代謝的fapR基因受ComA的調(diào)控。其自動(dòng)調(diào)整和控制多個(gè)涉及脂肪酸代謝的基因，編碼產(chǎn)物FapR是轉(zhuǎn)錄阻遏物，fapR、plsX、fabDG操縱子，yhdO、fabHB、fabHAF操縱子和fabL基因等涉及脂肪酸代謝的基因或操縱子都受FapR的調(diào)控或影響，也直接或間接受ComA的調(diào)控[33-34]。

目前，已鑒定出9個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的22個(gè)基因受ComQXPA路徑直接調(diào)控，近150個(gè)基因的表達(dá)受該路徑間接調(diào)控。這些受調(diào)控的基因大體涉及3個(gè)方面的功能：(1)調(diào)節(jié)涉及發(fā)育途徑中的生理變化；(2)調(diào)節(jié)高濃度培養(yǎng)物條件下產(chǎn)生有效胞外產(chǎn)物的行為；(3)在擁擠或限制擴(kuò)散的條件下增強(qiáng)菌體生存、生長和定殖能力。

3 枯草芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生防方面的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌作為農(nóng)作物生防菌的研究很多，其生防機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面。

3.1 產(chǎn)生脂肽類抗生素

高學(xué)文等[35]構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌GEB3菌株，能夠產(chǎn)生表面活性素，其對(duì)稻瘟病病原菌和小麥紋枯病病原菌菌絲具有抑制作用。肖曉露[36]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BS193菌株可產(chǎn)生伊枯草菌素、豐源菌素和表面活性素等3種脂肽類抗生素，抗菌作用廣譜，對(duì)辣椒疫病有顯著的抑制作用。楊桃[37]篩選到1株編號(hào)為Itb的枯草芽孢桿菌，其對(duì)煙草疫霉菌引起的煙草黑脛病有60%以上的大田防治效果；對(duì)生防菌發(fā)酵液進(jìn)行分離提取，結(jié)果顯示，其分泌的表面活性素為主要的抗菌成分。

3.2 產(chǎn)生抗菌蛋白

鄭小亮等[38]篩選到生防菌枯草芽孢桿菌Z1-2菌株，其產(chǎn)生的抗菌蛋白具有耐熱和耐紫外線特性，對(duì)小麥赤霉病有顯著的抑制效果。于杰等[39]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌B25菌株產(chǎn)生一種抗菌蛋白，其對(duì)香蕉枯萎病病原菌有較強(qiáng)抑制作用，致使菌絲和孢子膨大畸形。牛煥杰[40]從小麥根部分離到1株編號(hào)為E1R-j的枯草芽孢桿菌，該菌對(duì)由黑腐皮殼菌(Valsamali)引起的蘋果樹腐爛病有較好的防治效果；對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行分離提取及純化，抗菌活性成分為多肽，對(duì)病原菌菌絲有顯著的抑制作用，導(dǎo)致菌絲膨大和原生質(zhì)外滲等現(xiàn)象。

3.3 產(chǎn)生降解酶類

韓長志等[41]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌XF-1菌株可分泌多種碳水化合物酶類(Carbohydrate-active enzymes, CAZymes)，對(duì)多種植物病原菌有顯著的抑制作用。LIU等[42]對(duì)枯草芽孢桿菌SL-13菌株研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有分泌幾丁質(zhì)酶的特性，對(duì)番茄立枯病有較好的防治效果，且對(duì)番茄具有促生作用。

3.4 形成生物膜

王培培等[43]對(duì)枯草芽孢桿菌NCD-2菌株的comA基因突變子研究發(fā)現(xiàn)，生物膜形成有利于對(duì)番茄灰霉菌的抑制作用。

4 枯草芽孢桿菌ComQXPA系統(tǒng)在生物防治方面的潛在應(yīng)用

枯草芽孢桿菌的生防機(jī)制與其ComQXPA系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用緊密相關(guān)，隨著枯草芽孢桿菌 ComQXPA系統(tǒng)分子調(diào)控機(jī)制的深入研究，一些受直接調(diào)控的基因被克隆，構(gòu)建了一些高產(chǎn)分泌物的工程菌。顧曉波等[44]利用comA的超表達(dá)構(gòu)建枯草芽孢桿菌MO-L010菌株脂肽合成工程菌，脂肽產(chǎn)量提高了20%。ZHANG等[45]從棉花中分離出1株枯草芽孢桿菌ZK0，其產(chǎn)生的脂肽類抗生素iturin A能抑制農(nóng)作物病原真菌的生長，通過comA和sigA基因的超表達(dá)構(gòu)建工程菌，極大提高了iturin A的產(chǎn)量，可用于商業(yè)化生產(chǎn)。陸兆新等[46]以枯草芽孢桿菌ATCC9943為出發(fā)菌株，通過超表達(dá)comA基因，構(gòu)建了高產(chǎn)抗菌肽菌株FB27。利用ComQXPA系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，有方向性地構(gòu)建生防效果更好的工程菌，是研究人員努力的方向。

5 展望

關(guān)于枯草芽孢桿菌ComQXPA系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，人們還在進(jìn)行著深入的研究。對(duì)于該調(diào)控系統(tǒng)在生防方面的應(yīng)用，提出以下建議：分析清楚菌株的生防機(jī)制，如從強(qiáng)化生物膜的形成、加強(qiáng)抗性物質(zhì)的分泌以及提高生防菌的定殖能力等方面進(jìn)行研究，利用代謝工程策略優(yōu)化相應(yīng)合成途徑，構(gòu)建高產(chǎn)工程菌，增強(qiáng)枯草芽孢桿菌的生防效果。隨著研究的深入，ComQXPA系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用在枯草芽孢桿菌生物防治方面將具有巨大的應(yīng)用潛力。