張夢(mèng)嬌 ，王春艷 ，黃亞若 ，隆紅艷 ，司振陽(yáng) ，楊月娥

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，南京 210012；2南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046；3南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院 兒科，南京 210012

多發(fā)性抽動(dòng)癥（tourette syndrome，TS）是一種慢性神經(jīng)精神障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為不自主的、反復(fù)的肌肉抽動(dòng)引發(fā)的運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)和發(fā)生性抽動(dòng)[1，2]。該病多起肇于兒童時(shí)期，常以眨眼伴面肌抽動(dòng)為首發(fā)癥狀，其后病情可逐漸加重，相繼出現(xiàn)其他部位的運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)，伴或不伴發(fā)生性抽動(dòng)；部分患兒可合并多動(dòng)癥、強(qiáng)迫障礙、焦慮等異常行為及情緒問(wèn)題[3，4]。抽動(dòng)癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與神經(jīng)生化因素、環(huán)境因素、遺傳因素、社會(huì)心理因素、A族β-溶血性鏈球菌感染等因素有關(guān)[5]。

大量研究表明，抽動(dòng)癥的發(fā)生發(fā)展與大腦紋狀體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)有密切關(guān)系，降低大腦紋狀體內(nèi)炎癥因子表達(dá)有利于緩解和治療抽動(dòng)癥的癥狀[6]。

目前抽動(dòng)癥模型以 1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI）誘發(fā)大鼠為主，該模型較其他模型明顯而穩(wěn)定，表現(xiàn)效度較好，能夠較好地模擬人類(lèi)抽動(dòng)癥行為學(xué)特征。脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分，可以誘發(fā)炎癥反應(yīng)，破壞免疫系統(tǒng)功能。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)DOI聯(lián)合LPS造模，增強(qiáng)了抽動(dòng)癥模型大鼠的穩(wěn)定性。

玉屏風(fēng)散是中醫(yī)補(bǔ)益類(lèi)的代表方，具有益氣固表止汗之功效[7]。許多研究表明，玉屏風(fēng)散可以增強(qiáng)機(jī)體自身免疫力，減輕機(jī)體組織損傷及炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)以TLR/NF-κB信號(hào)通路為基礎(chǔ)，結(jié)合抽動(dòng)癥的發(fā)病機(jī)理，探討了其相關(guān)蛋白在抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織中的表達(dá)變化及玉屏風(fēng)散是否通過(guò)調(diào)節(jié)TLR/NF-κB信號(hào)通路、從而起到治療作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

玉屏風(fēng)散配方顆粒由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院提供（由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組方，配制比例為 2∶2∶1，批號(hào) 20170204，購(gòu)自江陰天江藥業(yè)）。

玉屏風(fēng)水煎液：按《中華人民共和國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，取黃芪、防風(fēng)和白術(shù)配方顆粒。黃芪∶炒白術(shù)∶防風(fēng)＝3∶1∶1，制備高、低濃度組，其生藥濃度分別是0.27 g·mL-1、0.135 g·mL-1。1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI，批號(hào) #549495）、脂多糖（LPS，批號(hào) L6511），均購(gòu)自 Sigma 公司。鹽酸硫必利（批號(hào)H32025447，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；IL-1β（E-EL-M0037c）、IL-6（E-ELN-M0047c）和TNF-α（E-EL-M0049c）酶聯(lián)免疫試劑盒由Elabscience 公司提供；TLR 2（#12276）、TLR 4（#14358）、p-IκB α（#2859）、IκB α（#4812）、NF-κBp65（#8242）和 p-NF-κBp65（#3033）抗體，均由 Cell Signaling Technology（Danvers，USA）公司提供。

1.2 儀器

BS124S-電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；D3024-臺(tái)式高速微量離心機(jī)、D3024R-臺(tái)式高速微量冷凍型離心機(jī)、SK-L180-E-搖床（美國(guó)Scilogex公司）；RT-6000-酶標(biāo)分析儀 （深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)）；GZX-9070 MBE-數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 （上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FR-200-塑料薄膜封口機(jī)（藍(lán)莓牌）；PHS-3L-pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；Tanon 5200-曝光儀 （上海天能科技有限公司）；F6/10-手持式高速勻漿器 （上海凈信科技）；DYC系列電泳儀 （北京市六一儀器廠）；Flyde動(dòng)物行為學(xué)儀器（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

60只雄性SD大鼠（體重200~220 g，合格證號(hào)SCXK（Jing）2017-0008）由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。大鼠于22℃±1℃、空氣濕度40%~50%、晝夜交替時(shí)間12h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

將60只SD大鼠隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、硫必利組（15mg·kg-1）、玉屏風(fēng)散低劑量（3.25 g·kg-1）組、玉屏風(fēng)散高劑量（6.5 g·kg-1）組。除空白組外，其他各組大鼠于腹腔注射1mg·kg-1DOI與1mg·kg-1LPS聯(lián)合制備大鼠抽動(dòng)癥模型?？瞻捉M以等體積生理鹽水代替造模劑，共造模21天。同時(shí)，硫必利組灌胃給予15 mg·kg-1硫必利和玉屏風(fēng)散低、高劑量組分別灌胃給予 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏風(fēng)散；空白組和模型組給予等體積生理鹽水，每天1次，共21天。

2.2 行為學(xué)測(cè)試

（1）運(yùn)動(dòng)行為學(xué)評(píng)估：最后一次給藥后24 h，將動(dòng)物放入一個(gè)較大的觀察籠，動(dòng)物適應(yīng)5 min，參照文獻(xiàn)評(píng)分：0分為安靜或正?；顒?dòng)；1分為過(guò)度興奮；2分為探究性為增加，不連續(xù)吸鼻；3分為不停跑動(dòng)；4分為不停跑動(dòng)伴有驚跳。（2）刻板行為學(xué)評(píng)估：參照Diammond方法對(duì)刻板行為評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)抽動(dòng)或刻板運(yùn)動(dòng)；1分為聳肩及口腔運(yùn)動(dòng)、理毛、舔食前爪等刻板動(dòng)作或旋轉(zhuǎn)行為；2分為頭和頸部上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多；3分為頭、頸部上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多加旋轉(zhuǎn)行為；4分為頭向側(cè)面擺動(dòng)合并頭、頸部上下運(yùn)動(dòng)過(guò)多。（3）分類(lèi)刻板行為學(xué)評(píng)估：參照文獻(xiàn)，記錄大鼠的面部刻板運(yùn)動(dòng)，這些刻板運(yùn)動(dòng)包括：口爪運(yùn)動(dòng)、吃木屑、自咬、擺頭（左右和上下擺動(dòng)幅度較大）、旋轉(zhuǎn)、舞蹈樣運(yùn)動(dòng)（身體直立，兩前爪抓籠子，頭及上半身左右擺動(dòng)）、舔咬籠子。在1 h觀察時(shí)間內(nèi)，記錄上述刻板行為出現(xiàn)的次數(shù)，每出現(xiàn)一次記1分。測(cè)試完畢后觀察籠內(nèi)的排泄物并清潔籠舍，以消除對(duì)下一大鼠的影響。連續(xù)觀察7天后每7天觀察一次直至造模結(jié)束。整個(gè)過(guò)程采取盲法觀察并記錄，由兩人分別觀察影像數(shù)據(jù)，以減少主觀誤差、且上述行為學(xué)數(shù)據(jù)由Flyde動(dòng)物行為學(xué)儀器采集。

2.3 血清和大腦紋狀體組織中炎癥因子的測(cè)定

行為學(xué)評(píng)分后，將大鼠用3%的水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血適量，4 500 r·min-1離心15 min，取上清血清液，凍存于-80℃?zhèn)溆??？焖俜蛛x出大腦組織，將大腦紋狀體組織置于生理鹽水中勻漿，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，取上清液凍存于-80℃?zhèn)溆?。采用BCA法測(cè)定蛋白含量。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清和大腦紋狀體組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

2.4 大腦紋狀體免疫學(xué)檢查

行為學(xué)評(píng)分后，將大鼠用3%的水合氯醛麻醉，頸總動(dòng)脈取血適量，快速分離出大腦組織，并在冰浴上剝離出紋狀體組織，生理鹽水洗凈，固定于10%的中性福爾馬林溶液中，脫水后用石蠟包埋，做成4~5μm切片，染色并于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。

2.5 Western blot分析

采用western blot檢測(cè)大鼠TLR/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白 TLR2（1∶1000）、TLR4（1∶1000）、p-IκB α（1∶1 000）和 p-NF-κBp65（1∶1 000）表達(dá)。大腦紋狀體組織總蛋白用RIPA裂解液進(jìn)行提取，12 000 r·min-1離心15 min，收集上清液。采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中，直至樣品到達(dá)分離膠的底部，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，將條帶浸入5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后，將PVDF膜分別浸入一抗中，于4℃孵育過(guò)夜。第二天棄一抗加入第二抗體于搖床、室溫孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光并用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描條帶，分析各條帶的灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠行為學(xué)的影響

由表1所示：（1）玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分的影響：與空白組相比，模型組大鼠在觀察期內(nèi)的運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分均高于正常組，給予15 mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏風(fēng)散后，大鼠的運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分均降低。（2）玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠刻板行為評(píng)分的影響：與空白組相比，模型組大鼠在觀察期內(nèi)的刻板行為評(píng)分均高于空白組，給予 15 mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5 g·kg-1的玉屏風(fēng)散后，大鼠的運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分均降低。（3）玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠分類(lèi)刻板行為評(píng)分的影響：與空白組相比，模型組大鼠在觀察期內(nèi)的口爪運(yùn)動(dòng)、吃木屑、自咬、擺頭等分類(lèi)刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分均高于空白組， 給予 15mg·kg-1硫必利及 3.25 g·kg-1、6.5g·kg-1的玉屏風(fēng)散后，大鼠的口爪運(yùn)動(dòng)、吃木屑、自咬、擺頭等分類(lèi)刻板運(yùn)動(dòng)評(píng)分均降低。

3.2 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠血清和大腦紋狀體組織中炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

由表2、表3所示：模型組大鼠血清和大腦紋狀體組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子含量顯著增加。與模型組相比，硫必利組（15 mg·kg-1）、玉屏風(fēng)散低劑量（3.25 g·kg-1）組、玉屏風(fēng)散高劑量（6.5 mg·kg-1）組的動(dòng)物血清和大腦紋狀體組織中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性細(xì)胞因子含量顯著降低。表明玉屏風(fēng)散可以通過(guò)減少炎癥因子的表達(dá)緩解大鼠抽動(dòng)癥的癥狀。

表1 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響（x±s，n=6）

表2 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響（x±s，n=6）

表3 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠紋狀體炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響（x±s，n=6）

3.3 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織NF-κB免疫組化染色的影響

由圖1所示：空白組大鼠大腦紋狀體組織免疫組化染色基本呈陰性。其他實(shí)驗(yàn)組大腦紋狀體組織中NF-κB在細(xì)胞及間質(zhì)中均有陽(yáng)性表達(dá)。模型組中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)明顯比空白組多，說(shuō)明造模成功。硫必利組NF-κB陽(yáng)性表達(dá)明顯低于模型組。玉屏風(fēng)散低、高劑量組陽(yáng)性表達(dá)同樣明顯低于模型組，說(shuō)明該散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠具有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表4。

圖1 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織NF-κB免疫組化染色的影響（免疫組化，×200，n=3）

3.4 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織TLR/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)玉屏風(fēng)散對(duì)TLR/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的改善作用。由圖2與表5所示：與空白組相比，模型組大鼠 TLR2、TLR4、p-IκBα、和p-NF-κBp65的表達(dá)上調(diào)，經(jīng)玉屏風(fēng)散低劑量（3.25 g·kg-1）組、玉屏風(fēng)散高劑量（6.5 g·kg-1）組治療后，這些蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散是通過(guò)TLR/NF-κB信號(hào)通路體現(xiàn)其對(duì)抽動(dòng)癥大鼠的治療作用。

表4 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)率的影響（±s，n=3）

表4 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織NF-κB 陽(yáng)性表達(dá)率的影響（±s，n=3）

玉屏風(fēng)散 低高組別 劑量（mg·kg-1） NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率（%）空白 - 7.43±1.22模型 - 27.87±1.18#硫必利 15 11.78±2.66▲3250 16.55±1.79▲6 500 13.66±1.71▲

圖2 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠大腦紋狀體組織TLR/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

表5 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠紋狀體TLR/NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

表5 玉屏風(fēng)散對(duì)抽動(dòng)癥大鼠紋狀體TLR/NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）

P-IκB α/IκB α空白 - 0.43±0.07 0.65±0.11 0.22±0.08 0.49±0.09模型 - 0.88±0.17#1.24±0.19#0.89±0.14#0.99±0.15#硫必利 15 0.58±0.12▲0.84±0.15▲0.38±0.06▲0.65±0.13▲3250 0.67±0.16▲0.98±0.23▲0.48±0.09▲0.78±0.11▲6500 0.62±0.13▲0.84±0.29▲0.44±0.05▲0.70±0.16▲組別 劑量（mg·kg-1）TLR 2/GAPDH TLR 4/GAPDH P-P65/P65玉屏風(fēng)散低高

4 討 論

抽動(dòng)癥是一種起病于兒童時(shí)期、以無(wú)目的、不自主的、快速、反復(fù)一個(gè)或多個(gè)部位肌肉運(yùn)動(dòng)性或發(fā)生性抽動(dòng)為特點(diǎn)的神經(jīng)經(jīng)神障礙疾病[8]。常伴隨注意缺陷多動(dòng)障礙、強(qiáng)迫障礙及自傷行為等，對(duì)患者的生活質(zhì)量和心理功能造成嚴(yán)重的損傷[9]。該病的病理基礎(chǔ)是基底神經(jīng)節(jié)功能紊亂及多巴胺系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng)，但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確[10]。目前抽動(dòng)癥模型以 1-（2，5-dimethoxy-4-iodo pheny l）-2-aminopropane（DOI）為主，該模型抽動(dòng)行為學(xué)體征較其他模型明顯而穩(wěn)定，表現(xiàn)效度較好，能夠較好地模擬人類(lèi)抽動(dòng)癥行為學(xué)特征[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DOI聯(lián)合LPS造模，增強(qiáng)了抽動(dòng)癥模型大鼠的成模性、穩(wěn)定性。

IL-6是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫功能的發(fā)生改變的重要介質(zhì)和多種生物學(xué)效應(yīng)的促炎因子。IL-1β是重要的炎癥細(xì)胞因子之一，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。TNF-α由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體損傷期間反應(yīng)最早和最強(qiáng)的介質(zhì)[12，13]。在本研究中，模型組大鼠血清和大腦紋狀體組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子含量顯著增加。與模型組相比，硫必利組（15mg·kg-1）、玉屏風(fēng)散低劑量（3.25 g·kg-1）組、玉屏風(fēng)散高劑量（6.5 g·kg-1）組的動(dòng)物血清和大腦紋狀體組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子含量顯著降低，表明玉屏風(fēng)散可以通過(guò)減少炎癥因子的表達(dá)緩解大鼠抽動(dòng)癥的癥狀。

最后，采用免疫組化和Western blot技術(shù)檢測(cè)紋狀體TLR/NF-κB信號(hào)蛋白表達(dá)水平，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是最重要的調(diào)控蛋白，參與細(xì)胞生存、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等細(xì)胞生命活動(dòng)。它由五個(gè)家族成員組成，靜息狀態(tài)下以同源二聚體或異源二聚體的形式存在，通過(guò)結(jié)合IκB家族蛋白，從而限制自身入核參與下游基因轉(zhuǎn)錄[14，15]。TLR 2、TLR 4 分布于除T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK以外的免疫細(xì)胞。大量研究表明，TLR 2、TLR 4與炎癥關(guān)系非常密切[16]。

總之，本研究表明，玉屏風(fēng)散可以緩解DOI聯(lián)合LPS誘導(dǎo)的大鼠抽動(dòng)癥，其機(jī)制可能與TLR/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。