胡天惠，林 超，項媛媛，辜衛(wèi)紅

1淮安市婦幼保健院，淮安 223002；2南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南京 210023

黨參為補脾益氣類中藥，潞黨參屬黨參中的上品，為山西潞州道地藥材[1]，含有大量多糖、蛋白質(zhì)、苷類、維生素和礦物類成分，是中醫(yī)臨床上常用的中藥之一，具有補中益氣、健脾益肺、養(yǎng)血生津的作用，主要用于治療四肢無力、食欲不佳、氣津兩虛、氣血雙虧以及血虛萎黃等諸癥[2-4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，潞黨參能夠增加癌癥放療患者白細(xì)胞數(shù)量、體液IgM水平、增強免疫功能[5，6]，表明潞黨參有增強免疫抑制機體的免疫功能。由潞黨參制成的潞黨參口服液具有補中益氣、健脾益肺、滋補強壯等功效，臨床上已廣泛用于脾虛型小兒泄瀉，婦產(chǎn)科貧血，慢性胃炎，慢性腎炎及放化療后脾肺氣虛等癥候，但是其能否增強免疫抑制小鼠的免疫功能未見報道。本研究采用環(huán)磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型[7，8]，探討潞黨參口服液對免疫抑制動物的免疫調(diào)節(jié)作用，為其臨床使用和后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品和試劑

潞黨參口服液（規(guī)格10 mL/瓶，批號：1801303，山西正來制藥有限公司，潞黨參提取物，每毫升相當(dāng)于生藥量1.667 g，使用時采用生理鹽水稀釋至實驗所需濃度）；10%綿羊紅細(xì)胞 （批號20180618，南京博碩生物科技有限公司）；RMPI1640培養(yǎng)基 （批號1918892，美國 Gibco公司）；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，批號 L2880，北京索萊寶科技有限公司）；刀豆蛋白 A （Concanavalin A，ConA，批號C2967，美國sigma公司）；胎牛血清（批號 11H228，依科賽生物科技有限公司）；噻唑藍 （MTT，批號SP1175，美國sigma公司）；小鼠 IL-2 Elisa試劑盒（批號L0603429）、小鼠IL-4 Elisa試劑盒 （批號L0815439）、小鼠 IFN-γ Elisa試劑盒 （批號L1126357），均為武漢華美生物工程有限公司；其余試劑均為化學(xué)純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

BioTek酶標(biāo)儀 （美國博騰儀器有限公司）；TC3111恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國 Thermo公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；Primo Star倒置顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.3 實驗動物

ICR 小鼠 240 只，體重（20~22）g，雌雄各半，由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2017-0007。動物飼養(yǎng)于無特定病原體動物（Specific Pathogen Free，SPF）屏障環(huán)境，溫度 20 ℃～22℃，相對濕度60%～70%。

2 實驗方法

2.1 模型建立、分組及給藥

將240只ICR小鼠按照體重隨機分6組，分別為：空白組、模型組、香菇多糖陽性藥（0.2 g·kg-1）組和潞黨參口服液低、中、高組（3.3、6.6、13.2 g·kg-1），每組40只。除空白組外，其余各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg·kg-1，每天一次，連續(xù)3 d建立免疫缺陷小鼠模型[7，8]。動物造模后 1 d開始給藥，連續(xù)14 d，空白組和模型組均灌胃給予生理鹽水。

2.2 動物體質(zhì)量和臟器指數(shù)的檢測

每組取10只小鼠，均于第14天給藥后，禁食不禁水12h，稱取小鼠的體質(zhì)量，摘眼球取血分離血清（用于后續(xù)血清細(xì)胞因子檢測），乙醚麻醉后處死小鼠，解剖小鼠分離胸腺和脾臟，小心取出周圍多余的結(jié)締組織，吸水紙吸去表面殘血，稱重并記錄。

2.3 小鼠血清中溶血素測定

每組取10只小鼠于造模后第一天腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞0.2 mL進行免疫，當(dāng)天開始給藥，末次給藥24h后小鼠摘眼球取血，室溫靜置3h，1500r·min-1離心15 min，分離上層血清。用生理鹽水將血清稀釋100倍。取1 mL稀釋好的血清樣品至試管中，依次加入5%綿羊紅細(xì)胞0.5 mL和10%豚鼠血清0.5 mL，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min后冰水浴終止反應(yīng)，取上清液1 mL于10 mL試管中，加入都氏液4 mL；同時另取一試管，加入5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.25mL后加入都氏液4mL，作為綿羊紅細(xì)胞的半數(shù)溶血值[9]。以不加小鼠血清的空白管調(diào)零，于540 nm處進行比色檢測，測定各管的OD值并計算半數(shù)溶血值（HC50）。公式為：

2.4 脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)

每組取10只小鼠于末次給藥后24 h，麻醉處死，置于75%乙醇中浸泡3 min，無菌條件下分離小鼠脾臟，剪碎脾臟并進行研磨，過200目細(xì)胞篩，采用RMPI1640培養(yǎng)基進行稀釋并離心，以細(xì)胞計數(shù)板進行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度后加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔細(xì)胞的數(shù)量為5×105個。各組血清設(shè)置3個處理方式：空白處理（只加入細(xì)胞懸液）；LPS處理 （加入LPS終濃度為10μg·mL-1和細(xì)胞懸液）；ConA處理 （加入ConA終濃度為5μg·mL-1和細(xì)胞懸液）。每組設(shè)置6個復(fù)孔。細(xì)胞處理后，將培養(yǎng)板置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)68 h。取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT溶液20μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 100μL混勻后，于490 nm波長處檢測各孔的OD值并計算細(xì)胞增殖率[10]。設(shè)定空白組脾淋巴細(xì)胞增殖率為100%，并計算各組小鼠淋巴細(xì)胞相對增殖率。

2.5 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力

每組取10只小鼠，乙醚麻醉后固定于解剖盤上，腹腔注射無血清的RPMI1640培養(yǎng)基4 mL，輕輕撫摸小鼠腹部2 min，小心在小鼠腹部剪口，移液器吸出培養(yǎng)液于無菌離心管中，2 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，以細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，加入96孔培養(yǎng)板中，使得每孔的細(xì)胞數(shù)量為1×105，培養(yǎng)板置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h貼壁，加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入10%HCL-SDS 100μL，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，于490 nm波長處測定OD值并計算吞噬指數(shù)。

2.6 小鼠血清IL-2、IL-4和IFN-γ水平檢測

取“2.2”中分離得到的各組小鼠眼球血的血清，按照Elisa試劑盒說明書進行IL-2、IL-4和IFN-γ水平檢測。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，Student-Newman-Keuls檢驗進行組間比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

造模后觀察到小鼠精神萎靡、毛發(fā)稀疏和攝食量減少的現(xiàn)象，表明環(huán)磷酰胺能夠造成小鼠免疫器官萎縮，免疫能力下降，免疫抑制小鼠模型建立成功。與空白組相比，模型組、香菇多糖組和潞黨參口服液組小鼠體重均顯著下降（P＜0.05），模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠體質(zhì)量、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，潞黨參口服液能夠促進免疫抑制小鼠免疫器官的發(fā)育，增強免疫能力。見表1。

表1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠體重及臟器指數(shù)的影響（±s，n=10）

脾臟指數(shù)/%空白組 - 34.26±4.89 0.79±0.16 0.18±0.04模型組 - 24.38±2.06## 0.46±0.09## 0.11±0.03##香菇多糖組 0.2 30.61±3.27** 1.33±0.14**0.25±0.05**3.3 26.47±2.73 0.68±0.11* 0.15±0.04 6.6 27.79±3.35* 0.93±0.19**0.19±0.09**13.2 28.66±3.82** 1.16±0.23** 0.22±0.08**注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。組別 劑量/g·kg-1 體重 胸腺指數(shù)/%潞黨參口服液組（低）（中）（高）

3.2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影響

與空白組相比，模型組血清溶血素水平顯著降低（P＜0.01）。血清溶血素水平是評價機體免疫能力的重要指標(biāo)，結(jié)果表明，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺能夠降低血清溶血素水平，對小鼠的免疫能力產(chǎn)生抑制作用。給予香菇多糖和潞黨參口服液治療后，香菇多糖組、潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）小鼠血清溶血素水平顯著提高，且高劑量組（13.2 g·kg-1）的血清溶血素水平高于陽性藥香菇多糖組，結(jié)果提示，潞黨參口服液能夠增加免疫抑制小鼠的血清溶血素水平，增強免疫功能。見表2。

表2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響（±s，n=10）

表2 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響（±s，n=10）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 血清溶血素（HC50）空白組 - 15.58±3.37模型組 - 8.85±2.16##香菇多糖組 0.2 12.37±3.58**3.3 9.94±2.89 6.6 10.64±3.05**13.2 13.08±3.29**（低）（中）（高）注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，**P＜0.01。

3.3 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)ConA與LPS分別誘導(dǎo)后，模型組脾T、B淋巴細(xì)胞增殖顯著降低，與空白組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）ConA 誘導(dǎo)的 T 淋巴細(xì)胞增殖顯著 （P＜0.01）；LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖顯著（P＜0.01）。見表 3。

3.4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響

與空白組相比，模型組腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著降低；與模型組相比，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），提示潞黨參口服液能夠增強小鼠非特異性免疫吞噬能力。見表4。

表3 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 T淋巴細(xì)胞/% B淋巴細(xì)胞/%空白組 - 100.00±11.26 100.00±12.48模型組 - 40.28±7.74## 45.33±8.15##香菇多糖組 0.2 117.48±12.15** 106.27±10.37**3.3 45.19±7.29 59.60±9.62*6.6 75.56±9.36** 78.82±9.92**13.2 92.18±10.26** 94.59±11.47**（低）（中）（高）注：與對照組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響（±s，n=10）

表4 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)的影響（±s，n=10）

潞黨參口服液組組別 劑量/g·kg-1 巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)空白組 - 1.51±0.72模型組 - 1.26±0.48##香菇多糖組 0.2 2.36±0.81**3.3 1.41±0.72 6.6 1.92±0.93*13.2 2.29±0.97**（低）（中）（高）注：與對照組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠IL-2、IL-4和IFN-γ的影響

與空白組相比，模型組血清中IL-2、IL-4和IFN-γ均顯著下降。經(jīng)香菇多糖和潞黨參口服液治療后，香菇多糖和潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2g·kg-1）血清中 IL-2、IL-4 和 IFN-γ 均顯著增加（P＜0.01），結(jié)果提示，潞黨參口服液能夠增強免疫抑制小鼠血清中免疫因子的水平，增強免疫作用。見表5。

表5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影響（±s，n=10）

表5 潞黨參口服液對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4和TNF-α 的影響（±s，n=10）

IFN-γ/pg·L-1空白組 - 150.94±21.84 71.75±11.28 318.27±47.64模型組 - 96.48±17.62##41.42±7.93##209.35±26.49##香菇多糖組 0.2 137.23±19.80**83.69±13.21**330.26±51.74**3.3 105.19±16.74 60.94±12.89*266.49±38.32*6.6 108.37±18.46**74.37±11.28**300.34±47.27**13.2 119.04±20.37**78.65±10.03**328.16±42.93**組別 劑量/g·kg-1 IL-2/pg·L-1 IL-4/pg·L-1潞黨參口服液組（低）（中）（高）注：與空白組相比，##P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討 論

環(huán)磷酰胺、長效類糖皮質(zhì)激素（氫化可的松、地塞米松等）、長春新堿等是構(gòu)建免疫缺陷型動物的常用造模劑。其中，環(huán)磷酰胺是一種烷化劑類細(xì)胞毒性藥物，能夠破壞DNA結(jié)構(gòu)，阻斷復(fù)制，殺傷快速分裂的免疫細(xì)胞，抑制動物的體液免疫和細(xì)胞免疫，造成動物免疫抑制[11，12]。本研究采用連續(xù)3天腹腔注射50 mg·kg-1環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，小鼠成模后出現(xiàn)蜷縮弓背、活動減少、不思飲食、毛發(fā)稀疏和體重減少等特征。小鼠解剖后，觀察發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，模型小鼠脾臟和胸腺明顯萎縮，這與其他文獻的報道相一致[7]，可以判定環(huán)磷酰胺制備的免疫缺陷型小鼠模型成功。

脾臟和胸腺含有大量的免疫細(xì)胞，是機體最主要的免疫器官，其臟器系數(shù)能一定程度上反映機體的免疫能力和狀態(tài)。實驗中通過對小鼠的脾臟和胸腺系數(shù)進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫抑制模型小鼠在接受潞黨參口服液治療后，其臟器指數(shù)明顯升高，表明潞黨參口服液能夠促進免疫抑制小鼠免疫器官的發(fā)育，增強免疫功能。同時，在血清溶血素形成實驗中，綿羊紅細(xì)胞致敏小鼠后，小鼠會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體即溶血素，反映了機體的特異性免疫水平。本實驗結(jié)果表明，潞黨參口服液中、高劑量組（6.6、13.2 g·kg-1）血清溶血素水平顯著升高，提示了潞黨參口服液能夠?qū)γ庖呷毕菪∈筇禺愋悦庖咚狡鸬酱龠M作用。

淋巴細(xì)胞是機體免疫系統(tǒng)的基本單位，是機體免疫應(yīng)答的主要承擔(dān)者，其細(xì)胞數(shù)量能一定程度上反映機體的免疫應(yīng)答能力和水平[13，14]。脾淋巴細(xì)胞增殖能力和功能是評價機體免疫能力的重要指標(biāo)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，潞黨參口服液能夠顯著促進LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖和ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖，同時也能夠增加巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，表明潞黨參口服液對環(huán)磷酰胺所致的小鼠淋巴細(xì)胞增殖減少和吞噬功能降低有一定的恢復(fù)作用。

除免疫細(xì)胞之外，血液中的免疫因子在機體免疫反應(yīng)中也具有極其重要的作用[15]。IL-4主要由活化Th2細(xì)胞所分泌，具有活化B淋巴細(xì)胞并促進其增殖產(chǎn)生抗體的作用；IL-2和IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，IL-2在維持T細(xì)胞的分裂增殖，誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的分化和增殖方面具有重要作用；IFN-γ具有直接促進T、B細(xì)胞分化成熟，并促進巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。本研究結(jié)果表明，在環(huán)磷酰胺建模小鼠血清中，IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平明顯降低，潞黨參口服液能夠顯著增加小鼠血清中IL-4、IL-2和IFN-γ因子的水平，表明潞黨參口服液能夠提高免疫抑制小鼠的免疫能力。

綜上所述，潞黨參口服液可以通過促進免疫器官的發(fā)育、免疫細(xì)胞增殖和提高免疫因子水平，共同對免疫抑制小鼠產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。因此，潞黨參口服液具有免疫增強的作用，值得為后續(xù)臨床和實驗研究提供參考。