郭薇霞,唐 健,何建萍,羅勝軍,黃 鎧,林克勤,褚嘉祐,楊昭慶△

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室,云南昆明 650118;2.昆明市婦幼保健院遺傳室,云南昆明 650031)

β-地中海貧血是由β珠蛋白基因突變導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈合成速率降低或缺如所引起的血紅蛋白病，呈常染色體單基因隱性遺傳[1]。β-地中海貧血在中國(guó)人群中的分布以南方為主，其中廣西、廣東、海南和云南等地區(qū)是高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率高達(dá)7%～20%以上[2-3]。β-地中海貧血主要有2類，完全不能合成β鏈的稱為β0地中海貧血，能部分合成β鏈稱為β+地中海貧血。其臨床表現(xiàn)與基因突變類型相關(guān)，其中雜合子攜帶者常表現(xiàn)為輕度小細(xì)胞低色素貧血或無(wú)明顯臨床癥狀，而β0地中海貧血純合子以及一些β0/β+復(fù)合雜合子會(huì)產(chǎn)生中到重度的溶血性貧血癥狀，需通過(guò)長(zhǎng)期輸血和祛鐵治療維持生命[4]。因此開(kāi)展地中海貧血孕前、產(chǎn)前篩查對(duì)減少重型地中海貧血患兒的出生具有重要意義。目前我國(guó)臨床檢驗(yàn)上采用反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)β-地中海貧血基因主要針對(duì)常見(jiàn)的17種突變類型，不能檢測(cè)到罕見(jiàn)的突變類型，具有一定局限性。近年來(lái)，一些罕見(jiàn)突變陸續(xù)被報(bào)道和發(fā)現(xiàn)[5-7]，但目前對(duì)罕見(jiàn)地中海貧血突變的類型、分布和檢測(cè)策略仍然缺乏了解，臨床診治中對(duì)其基因型與表型的關(guān)系和臨床病理意義也缺乏認(rèn)知。因此本研究報(bào)道了2例罕見(jiàn)型β0突變Codon5(-CT)，并對(duì)基因型和表型進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 2例患者均為女性，漢族，年齡分別為24歲和36歲，云南省昆明籍貫。二者之間無(wú)血緣關(guān)系，于云南省昆明市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)前地中海貧血篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)疑似地中海貧血。根據(jù)知情同意原則獲取患者乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周靜脈血2～3 mL。

1.2方法

1.2.1血液學(xué)檢查 采用血細(xì)胞分析儀sysmex XT-2000i(日本)及配套試劑檢測(cè)患者外周靜脈血紅細(xì)胞血紅蛋白含量(HBG)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)和平均血紅蛋白含量(MCH)等血常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。血紅蛋白電泳及定量分析采用歐洲Helena V8全自動(dòng)等電聚焦毛細(xì)管電泳儀和配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2常見(jiàn)地中海貧血突變基因檢測(cè) 采用Axygen公司(杭州)的AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒從外周靜脈血樣中分離基因組DNA。采用基于PCR-反向點(diǎn)雜交法的地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(亞能生物技術(shù)公司，中國(guó)深圳))檢測(cè)23種見(jiàn)中國(guó)人常見(jiàn)的α-和β-地中海貧血基因型(SEA、-α3.7、-α4.2、αCSα、αQSα、αWSα、41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、IVS-I-5M、27/28M、43M、-29M、-30M、31M、-32M、14-15M、IntM和CAPM)。

1.2.3β珠蛋白基因測(cè)序 引物序列參照文獻(xiàn)[8],由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成,擴(kuò)增包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子序列及3個(gè)外顯子在內(nèi)β珠蛋白基因序列,共1 973 bp。PCR擴(kuò)增采用大連寶生物公司的TaKaRa LA Taq酶，擴(kuò)增體系為30 μL:每一反應(yīng)體系含10×Mix Buffer 3 μL、dNTP 3 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.3 μL、H2O 20 μL、DNA模板含量約100 ng。使用美國(guó)ABI公司的9700PCR擴(kuò)增儀，反應(yīng)條件為：94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸20 min。純化PCR產(chǎn)物后，送昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1血液學(xué)檢查結(jié)果 2例患者的血常規(guī)和血紅蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，MCV、MCH降低，均為明顯的小細(xì)胞低色素，血紅蛋白結(jié)果顯示2例患者為輕度貧血。血紅蛋白電泳結(jié)果顯示2例患者HbA2水平異常升高，提示β-地中海貧血。

2.2基因型檢測(cè)結(jié)果 二者均未檢出中國(guó)人中常見(jiàn)的α、β-地中海貧血基因突變。β珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)2例患者均有Codon 5(-CT)β0雜合突變，國(guó)際命名法(HGVS name)：HBB:c.17_18delCT，部分測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1。其中患者B還檢出HBB基因多態(tài)性HBB:c.9T>C,CD2 His>His，為同義突變。

表1 患者A、B基因型與血液學(xué)表型

圖1 患者A和患者B β珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果圖

3 討 論

β-地中海貧血具有較大的遺傳異質(zhì)性，存在地域和民族分布差異[9]。目前世界上已報(bào)道800多種β基因突變類型，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的超過(guò)了60種，常見(jiàn)的突變類型有-28M、17M、41-42M、71-72M、654M，這5種突變占我國(guó)β-珠蛋白基因突變的90%以上[10]。而云南分布最多、報(bào)道較多的是17M、41-42M、βEM突變[11]。本研究聯(lián)合運(yùn)用血液學(xué)檢查、常見(jiàn)地中海貧血基因檢測(cè)和HBB基因測(cè)序，在云南昆明地區(qū)鑒定出2例罕見(jiàn)Codon 5(-CT)β0雜合突變，進(jìn)一步擴(kuò)展了云南人群中的地中海貧血突變譜。

罕見(jiàn)型β0地中海貧血-5(-CT)是由于β珠蛋白基因第5位密碼子CCT缺失了CT 2個(gè)堿基，產(chǎn)生移碼突變，使得β鏈的合成在第21位密碼子就提前終止，完全不能合成β鏈。這一突變首次在一希臘患者中被報(bào)道[12]，隨后國(guó)外多個(gè)人種中都有報(bào)道[13-14]。根據(jù)人類血紅蛋白變異體數(shù)據(jù)庫(kù)HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)顯示，這一突變?cè)谟?guó)人中的分布最高，達(dá)到了8.7%。而我國(guó)僅有檢出1例的報(bào)道，目前缺少在群體中的分布頻率。[15]，本研究這是第2次報(bào)道。由于本研究和之前的報(bào)道都是在云南人群中檢出這一突變，國(guó)內(nèi)其他地區(qū)尚未見(jiàn)報(bào)道，這是否說(shuō)明該突變的分布和頻率存在明顯的地域差異，還有待于進(jìn)一步研究。

國(guó)外研究顯示這一突變表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素輕度貧血[4]，而我國(guó)目前仍然缺乏該突變的臨床信息。本研究中這2例患者為β0地中海貧血-5(-CT)雜合子，二者都呈現(xiàn)明顯的小細(xì)胞低色素輕度貧血，血紅蛋白電泳結(jié)果HbA2增高，臨床表現(xiàn)為輕型地中海貧血，這與國(guó)外研究相一致。盡管該突變雜合子不產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，也無(wú)需接受治療，但是由于云南是地中海貧血和異常血紅蛋白病高發(fā)區(qū)，罕見(jiàn)突變攜帶者與常見(jiàn)地中海貧血突變攜帶者婚配后，有可能生下復(fù)合雜合子患兒，產(chǎn)生嚴(yán)重的臨床表型。已有文獻(xiàn)報(bào)道，β0地中海貧血-5(-CT)合并β+IVS-I-5 (G->A)則產(chǎn)生重型地中海貧血表現(xiàn)，需要長(zhǎng)期輸血治療[12]。因此，有必要對(duì)罕見(jiàn)突變進(jìn)行鑒定，從而進(jìn)一步研究其人群發(fā)生率和臨床危害性。

根據(jù)患者血液學(xué)表型，這2例患者疑似為β-地中海貧血攜帶者，而通過(guò)地中海貧血常規(guī)基因檢測(cè)并未檢出我國(guó)常見(jiàn)的17種β基因突變類型。因此推測(cè)這2例患者可能存在非中國(guó)人常見(jiàn)的17種突變位點(diǎn)之外的突變，隨后通過(guò)對(duì)HBB基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而成功檢出這2例罕見(jiàn)突變。由此可見(jiàn)，目前的常規(guī)地中海貧血檢測(cè)試劑盒往往會(huì)造成罕見(jiàn)突變的漏檢，因此在臨床檢驗(yàn)中，應(yīng)嚴(yán)格遵循血液學(xué)表型與基因型相結(jié)合的原則，當(dāng)血液學(xué)表型與地中海貧血基因型不相符合時(shí)，應(yīng)該考慮珠蛋白基因測(cè)序的方法，以明確是否存在罕見(jiàn)或新發(fā)的地中海貧血突變類型，避免漏診。

本研究報(bào)道了2例罕見(jiàn)型β0地中海貧血-5(-CT)，進(jìn)一步擴(kuò)展了云南β珠蛋白基因突變譜。通過(guò)基因型和表型探討，β0地中海貧血-5(-CT)雜合子表現(xiàn)為輕型地中海貧血。由于云南是地中海貧血高發(fā)區(qū)，為了避免復(fù)合雜合子的產(chǎn)生，聯(lián)合運(yùn)用血液學(xué)、血紅蛋白電泳、常規(guī)地中海貧血基因檢測(cè)以及基因測(cè)序等，有利于明確患者基因型，更好地指導(dǎo)臨床診治、產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢。