陳榮，張華鋒

（蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心，江蘇 蘇州 215104）

活血止痛膠囊組方為當(dāng)歸、三七、醋乳香、冰片、 土鱉蟲、鍛自然銅等六味，收錄于2015年版《中國藥典》一部，功能為活血散瘀，消腫止痛，用于跌打損傷，瘀血腫痛?！吨袊幍洹穂1]對此藥含鉛、砷、汞量作出規(guī)定，其中砷含量不得過300 mg/kg，遠(yuǎn)高于一般藥物的2 mg/kg。有研究表明[2]，當(dāng)歸藥材對砷元素有明顯吸附作用，對不同產(chǎn)地三七樣品進(jìn)行分析，砷超標(biāo)率為32.4%[3]，土鱉蟲由于人為增重，食物團(tuán)比蟲體含砷量明顯提高[4]，自然銅作為一種礦物藥，成因復(fù)雜，往往含有較高的重金屬及有害元素。因此，評價(jià)活血止痛膠囊安全性必須要考慮砷含量問題。而不同砷價(jià)態(tài)，毒性差別很大。毒性一般為無機(jī)砷＞有機(jī)砷，亞砷酸（三價(jià)砷）＞砷酸鹽（五價(jià)砷）＞一甲基砷、二甲基砷，砷甜菜堿和砷膽堿無毒[5]。本實(shí)驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定活血止痛膠囊中總砷及可溶性砷含量，再以高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS）法測定價(jià)態(tài)砷的含量，以期為科學(xué)評價(jià)活血止痛膠囊安全性提供參考。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

儀器：7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；CEM MARS 6 CLASSIC 微波消解儀（美國培安公司）；Millipore Synergy超純水機(jī)（美國Millipore公司）；SK5200 HP超聲波清洗器（上?？茘u超聲儀器有限公司，53 kHz，200 W）；Thermo Fisher Multifuge X3離心機(jī)（美國Thermo Fisher科技公司）。

試劑：亞砷酸（AsⅢ，1704）、砷酸鹽（AsV，1704）、一甲基砷（MMA，1707）、二甲基砷（DMA，1704）、砷甜菜堿（AsB，1607）和砷膽堿（AsC，1607）溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購于中國科學(xué)計(jì)量研究院；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（174049-3）購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心，濃度為1 000 μg/mL；內(nèi)標(biāo)溶液（含Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb 各 100 μg/mL）和調(diào)諧液（含 Ce、Co、Li、Mg、TI、Y 各 1 μg/L）均購于美國Agilent 公司。胃蛋白酶和胰蛋白酶均為生化試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，酶活力（U/g）分別為≥1 200和≥50 000。實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水機(jī)所產(chǎn)超純水，其他試劑均為優(yōu)級純。

1.2 材料

本實(shí)驗(yàn)共收集7批樣品，其中A廠3批（16070119、16080118、17020128，編號1、2、3）；B廠3批（20161208、20161011、20161209，編號 4、5、6）；C 廠 1 批（160915，編號 7）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總砷量和可溶性砷含量測定

2.1.1 ICP-MS工作條件以高純氬為工作氣和載氣，氦氣為反應(yīng)氣；采用碰撞反應(yīng)池模式；射頻功率1550 W；載氣流量1.09 L/min；采樣深度10.0 mm；霧化室溫度2℃；數(shù)據(jù)采集重復(fù)次數(shù)3，積分時(shí)間1 S；蠕動泵轉(zhuǎn)速0.1 rps。

2.1.2 對照品溶液配制精密量取砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用2%硝酸稀釋至2 μg/mL，作為砷單元素貯備液，再以2%硝酸稀釋成0、1、5、10、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 總砷量供試品制備取供試品10粒，將內(nèi)容物研細(xì)混勻，取供試品約0.4 g，精密稱定，加硝酸8 mL，置加熱板上90℃預(yù)消解30分鐘，冷卻后用微波消解儀消解。消解程序：1000 W，爬坡5分鐘，120℃保持10分鐘；1400 W，爬坡10分鐘，185℃保持25分鐘。取出，將消解液轉(zhuǎn)入50 mL塑料量瓶中，用水洗滌3次，洗液合并于量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。離心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液1 mL，置50 mL塑料量瓶中，用水稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

2.1.3.2 可溶性砷供試品制備取供試品10粒，將內(nèi)容物研細(xì)混勻，取供試品約0.3 g各兩份，精密稱定，置50 mL塑料量瓶中，分別加入人工胃液和人工腸液至刻度，并稱定重量。超聲使供試品徹底溶散，再置于37℃水浴中超聲2 h（53 kHz，200 W）并不時(shí)震蕩搖勻。冷卻過夜（＞24 h），精密量取中層液體10 mL置離心管中，離心（3 000 r/min，5 min），精密量取上清液5 mL，至10 mL塑料量瓶中，加0.02 mol/L EDTA-2Na至刻度，精密量取1 mL至頂空進(jìn)樣瓶中，加2 mL硝酸和0.5 mL鹽酸，密閉，90℃烘箱中反應(yīng)1 h，冷卻后用水洗入10 mL塑料量瓶中，并稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察按測定條件以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對照品峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Y= 0.0017X+ 1.6811×10-5（R= 1.0000），線性范圍1～50 ng/mL。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)將樣品1（16070119）分別按照2.1.3.1、2.1.3.2方法各制備6份，測得總砷量RSD（n=6）為7.8%，測得可溶性砷含量RSD（n=6，人工胃液）11.5%和RSD（n=6，人工腸液）為10.8%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 加樣回收試驗(yàn)稱取樣品5（20161011）約0.2 g，精密稱定，在測定總砷量時(shí)精密加入砷單元素標(biāo)準(zhǔn) 溶 液（1 000 μg/mL）40、60、80 μL（ 各 3份 ），按照2.2.3.1項(xiàng)下方法制備，測得平均加樣回收率為98.4%，RSD（n=9）為9.4%；在測定可溶性砷含量時(shí)精密加入砷單元素貯備液（2 μg/mL）200、250、300 μL（各3份），按照2.2.3.2項(xiàng)下方法制備，測得人工胃液處理的平均加樣回收率為89.2%，RSD（n=9）為11.7%，測得人工腸液處理的平均加樣回收率為90.8%，RSD（n=9）為7.2%。

2.1.4.4 檢出限標(biāo)樣空白溶液連續(xù)測定11次，以信號響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（δ）的3 倍所對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，測定砷的檢出限為0.01 ng/g。

2.1.5 總砷量和可溶性砷含量測定7批樣品的可溶性砷含量低于總砷量，占總砷比例較低。見表1。

表1 砷含有量測定結(jié)果

2.2 價(jià)態(tài)砷含量測定

2.2.1 ICP-MS工作條件和HPLC色譜條件 ICP-MS工作條件、參數(shù)設(shè)置與2.1.1基本相同，載氣流量1.10 L/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速0.4 rps。色譜柱：Hamilton PRP-X100（250×4.1 mm，10 μm），0.025 mol/L 磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH至8.0）為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫（0～15 min，流動相A從0→100%；15～20 min，流動相A從100%→0；20～25 min，流動相A為0），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備精密稱取亞砷酸、砷酸鹽、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜堿和砷膽堿適量（以砷As計(jì)），加水制成各含2 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，再加 0.02 mol/L EDTA-2Na制成 0，5，20，50，100，500 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.3 供試品溶液制備同2.1.3.2項(xiàng)下方法制備，并同法制備空白。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性關(guān)系考察按測定條件以各價(jià)態(tài)砷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以及相應(yīng)峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各價(jià)態(tài)砷在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見圖1及表2。

圖1 6 種價(jià)態(tài)砷 HPLC-ICP-MS 色譜圖

2.2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)7批樣品都只檢出亞砷酸（AsⅢ），將樣品1（16070119）分別按照2.2.3方法制備6份，測得亞砷酸根含量RSD（n=6，人工胃液）為7.5%和RSD（n=6，人工腸液）為11.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

表2 各價(jià)態(tài)砷線性關(guān)系

2.2.4.3 加樣回收試驗(yàn)稱取樣品5（20161011）約0.2 g，精密稱定，分別加入亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.04、0.06、0.08 g（以砷 As計(jì)，濃度為 75.7 μg/g），精密稱定各 3 份，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備，測得人工胃液處理的平均加樣回收率為91.9%，RSD（n=9）為6.3%，測得人工腸液處理的平均加樣回收率為88.4%，RSD（n=9）為9.2%。

2.2.4.4 檢出限以信噪比（S/N）為3∶1時(shí)所對應(yīng)的濃度為檢出限，計(jì)算得到6種價(jià)態(tài)砷的檢出限分別為：砷膽堿0.19 ng/g；砷甜菜堿0.25 ng/g；亞砷酸根0.35 ng/g；二甲基砷0.50 ng/g；一甲基砷1.02 ng/g；砷酸根0.04 ng/g

2.2.5 樣品中砷價(jià)態(tài)的測定7批樣品三價(jià)砷含量測定結(jié)果見圖2及表3。

圖2 樣品HPLC-ICP-MS 色譜圖

表3 樣品中三價(jià)砷含量測定結(jié)果

3 討論

含重金屬中藥的毒性與所含重金屬元素價(jià)態(tài)、形態(tài)密切相關(guān)，僅采用重金屬總含量來判定藥物的安全性并不合理。特別是中藥復(fù)方制劑配伍，及中藥中重金屬在體內(nèi)吸收、代謝變化規(guī)律都有待進(jìn)一步研究。

活血止痛膠囊是含礦物藥自然銅的復(fù)方制劑，生產(chǎn)前后存在砷污染的高風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用微波消解技術(shù)提取總砷，同時(shí)模擬人體胃腸道環(huán)境，分別以人工胃液、腸液提取可溶性砷、價(jià)態(tài)砷，結(jié)合HPLC-ICPMS技術(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示①活血止痛膠囊可溶性砷及價(jià)態(tài)砷均遠(yuǎn)低于總砷含量，按照體重60 Kg每日最大攝入量3 g計(jì)算，可溶性砷攝入量也遠(yuǎn)低于WHO規(guī)定的0.12 mg[6]。②3家廠商測得總砷量相差較大，但同一家不同批次間相差不多；③7批樣品經(jīng)人工胃液和腸液分別提取后測得的可溶性砷含量，人工胃液＞人工腸液，各批亞砷酸占可溶性砷的比例，人工腸液＞人工胃液。多數(shù)含有砷的礦物藥是以As（Ⅲ)、As（V）的形式存在，其中As（Ⅲ）毒性更高（約是五價(jià)砷的60倍），是造成急性砷中毒的主要兇手[7]。而重金屬及有害元素的生物活性只有在被吸收后才能表現(xiàn)出來，因此在活血止痛膠囊中控制可溶性砷及三價(jià)砷含量比單純控制總砷量更為重要。

活血止痛膠囊雖然存在總砷量較高的風(fēng)險(xiǎn)，但在人體內(nèi)溶出量有限，價(jià)態(tài)砷含量很低，這可能是因?yàn)椋孩俜街胁捎缅懽匀汇~入藥，自然銅是硫化物類礦物黃鐵礦（FeS2)，晶型多呈立方體，集合體呈致密塊狀[7]，經(jīng)鍛淬后，有害元素大大下降，隨著炮制溫度升高，砷、鉛含量均下降[8]，主成分FeS2化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水，微溶于酸，消解困難，在人胃腸液作用下，砷很難溶出；②本實(shí)驗(yàn)只檢出亞砷酸，且含量與可溶性砷量并不成正比，可能方中砷以實(shí)驗(yàn)以外其他價(jià)態(tài)存在；③方中其他藥材如果在源頭控制住質(zhì)量，砷超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)就會降低，價(jià)態(tài)砷也不會超標(biāo)。

綜上所述，控制含砷風(fēng)險(xiǎn)高的中成藥質(zhì)量，測定可溶性砷及砷價(jià)態(tài)含量比單純制定總砷標(biāo)準(zhǔn)更為科學(xué)合理。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法測定活血止痛膠囊總砷量及可溶性砷含量，同時(shí)采用HPLC-ICP-MS測定本品價(jià)態(tài)砷含量，為活血止痛膠囊的安全性評價(jià)提供參考。