鄭孝振，韓簫笛，宋俊杰，毛姍姍，白明松，洪道先

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 475000）

N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）為細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，細(xì)胞中分布廣泛，生物學(xué)功能復(fù)雜。當(dāng)外周神經(jīng)發(fā)生損傷后，脊神經(jīng)纖維會(huì)釋放出大量的降鈣素基因相關(guān)肽和興奮性氨基酸[1-2]，通過激活脊髓背角神經(jīng)元的突觸后膜，產(chǎn)生快速的突觸電位，從而解除NMDA受體上的壓力，激活NMDA受體，開放鈣離子，進(jìn)一步增加NMDA受體的數(shù)量，增強(qiáng)突觸后神經(jīng)元的興奮性。有研究報(bào)告表明，舒芬太尼可有效緩解神經(jīng)病理性疼痛程度[3-4]。本研究旨在評(píng)價(jià)鞘內(nèi)注射舒芬太尼對(duì)神經(jīng)性痛大鼠脊髓背角內(nèi)NMDA受體表達(dá)的影響，為舒芬太尼在慢性神經(jīng)痛中的應(yīng)用途徑、劑量以及效果提供參考依據(jù)[5]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，購自上海生工動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量200～250 g，自由進(jìn)食，溫度22℃～25℃，濕度55%左右，晝夜比1︰1，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。隨機(jī)選擇5只作為空白對(duì)照組，其余大鼠制備慢性坐骨神經(jīng)損傷模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組和觀察組，各15只。

1.2 制備慢性神經(jīng)痛模型

大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，側(cè)臥位固定，距股骨下1 cm沿股骨走形切開皮膚，鈍性分離充分顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)和周圍組織，游離主干分叉以前約8 mm，含鉻羊腸線在神經(jīng)起始點(diǎn)2 mm處將坐骨神經(jīng)結(jié)扎4道，每道相隔1 mm，局部生理鹽水沖洗，間斷縫合皮下組織。以大鼠出現(xiàn)縮足、舔尾等行為，疼痛陽性反應(yīng)為建模成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

觀察組鞘內(nèi)注射舒芬太尼1 μg+氯化鈉注射液稀釋至10 μL，模型組注射等量0.9%氯化鈉注射液；分別于造模后即刻、3 d和5 d評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)功能，熱縮足反射潛伏期法（TWL）檢測(cè)疼痛閾值，免疫組化染色法檢測(cè)脊髓背角NMDA受體陽性表達(dá)。

1.4 鞘內(nèi)注射

建模后2 h大鼠吸入異氟烷麻醉，俯臥位固定，選取L3～L4間隙為切口位置，縱形切口長(zhǎng)度3 cm，鈍性分離肌肉組織，顯露L3～L4脊突間隙；利用25 G針穿刺黃韌帶和硬脊膜，待腦脊液流出視為穿刺成功。將導(dǎo)管經(jīng)硬脊膜口緩慢插入8 cm，開口端固定于L1～L2，另一端經(jīng)皮下隧道在頸背部引出，外露2 cm將導(dǎo)管口夾閉并固定。待大鼠麻醉失效后，微量注射10 μL舒芬太尼或0.9%氯化鈉注射液，以10 s內(nèi)雙肢出現(xiàn)無法負(fù)重、無逃避反應(yīng)且20 min可恢復(fù)為注射成功。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分：0分為運(yùn)動(dòng)功能無改變，可以正常行走；1分為運(yùn)動(dòng)輕度受限，足底刺激可出現(xiàn)正?？s爪反應(yīng)；2分為自主運(yùn)動(dòng)能力減低，中度運(yùn)動(dòng)受限；3分為自主活動(dòng)完全受限，無法行走。

1.5.2 疼痛閾值檢測(cè)：把大鼠放在有機(jī)玻璃箱中，置于玻璃板上，適應(yīng)30 min后，采用紅外線光束照射大鼠術(shù)側(cè)足底中部，至大鼠表現(xiàn)逃避性行為終止，熱刺激基礎(chǔ)強(qiáng)度設(shè)定10 s，自動(dòng)切斷時(shí)間設(shè)定20 s，每只大鼠測(cè)量5次，間隔時(shí)間5 min，取平均值。

1.5.3 免疫組化染色法：常規(guī)制作脊髓背角組織切片，厚度5 μm，經(jīng)脫蠟、水化，抗原修復(fù)和封閉后；滴加兔抗鼠NMDA受體單克隆抗體一抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰2000），置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌；滴加羊抗兔IgG多克隆抗體二抗（江蘇碧云天科技有限公司，工作濃度1︰500），置于濕盒中27℃孵育20 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（江蘇碧云天科技有限公司），置于濕盒中27℃孵育20 min，PBS振蕩洗滌5 min×3次；DAB顯色、復(fù)染、透明、中性樹膠封片、光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果判定：采用半定量法，依據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比率；以胞漿或胞核黃染至深棕色為陽性，染色強(qiáng)度中無陽性染色為0分，弱染色為1分，中等強(qiáng)度染色為2分，強(qiáng)染色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)比率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩項(xiàng)乘積0～3分為陰性，4～12分為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分的比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分逐漸下降，顯著低于造模后即刻，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組不同時(shí)間變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較

2.2 疼痛閾值比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組不同時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 疼痛閾值的比較

2.3 脊髓背角NMDA受體陽性表達(dá)比較

造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組3 d和5 d陽性表達(dá)較造模后即刻逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組不同時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3

表3 脊髓背角NMDA受體陽性表達(dá)比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠作為研究對(duì)象，大鼠選擇性神經(jīng)損傷模型（SNI）引起的神經(jīng)損傷程度穩(wěn)定，且重復(fù)性好，誘發(fā)行為表現(xiàn)更加持久，損傷傳入神經(jīng)元，能夠模擬臨床上神經(jīng)病理性疼痛的特征，是一種較為穩(wěn)定的大鼠模型。本研究探討舒芬太尼減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制，選擇術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后即刻模型組和觀察組大鼠的疼痛閾值較對(duì)照組明顯降低；觀察組3 d和5 d的疼痛閾值較造模后即刻顯著升高，差異顯著；模型組不同時(shí)間點(diǎn)的疼痛閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明鞘內(nèi)注射舒芬太尼對(duì)神經(jīng)性痛大鼠的痛覺有顯著改善作用，可減輕神經(jīng)疼痛。造模后即刻模型組和觀察組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著高于對(duì)照組；觀察組3 d和5 d運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分逐漸下降，顯著低于造模后即刻；模型組不同時(shí)間點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明舒芬太尼可以在減輕大鼠神經(jīng)痛的同時(shí)，恢復(fù)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能。造模后即刻模型組和觀察組大鼠脊髓背角NMDA受體陽性表達(dá)顯著高于對(duì)照組；觀察組3 d和5 d陽性表達(dá)較造模后即刻逐漸降低，差異顯著。說明建模后大鼠脊髓背角NMDA受體量及陽性表達(dá)量增加，使用舒芬太尼后可降低大鼠脊髓背角NMDA的陽性表達(dá)，可能是通過抑制降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）激活和NMDA釋放有關(guān)。大鼠發(fā)生神經(jīng)痛后，導(dǎo)致CGRP表達(dá)和脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體上調(diào)，提示這兩種受體均參與了神經(jīng)病理性疼痛的維持和形成。舒芬太尼可通過下調(diào)這兩種受體的表達(dá)，來減輕疼痛感，但具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究討論。

綜上所述，鞘內(nèi)注射舒芬太尼可減少神經(jīng)痛大鼠脊髓背角NMDA受體的表達(dá)，減輕疼痛感，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力。該研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于為舒芬太尼在慢性神經(jīng)痛中的應(yīng)用途徑以及效果提供參考依據(jù)，但是未能深入分析舒芬太尼對(duì)NMDA受體不同亞型的表達(dá)水平及作用效應(yīng)，觀察時(shí)間有限，舒芬太尼對(duì)慢性神經(jīng)痛的遠(yuǎn)期干預(yù)效果還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。