徐文華，鄭景輝，楊文娜，董音汝，趙 陽(yáng)，趙新望

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧 530011；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院心內(nèi)科，南寧 530000

哮喘是由多種細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥性疾病。目前，全球至少有3億哮喘患者[1]。中醫(yī)認(rèn)為哮喘是一種發(fā)作性的痰鳴氣喘疾患[2]小青龍湯出自張仲景《傷寒論》，方中麻黃、桂枝、細(xì)辛解表；溫散痰飲；半夏降逆化痰；甘草和中諸藥相互配合，溫肺化飲，化痰平喘，肺氣復(fù)舒，宣降有權(quán)，諸癥悉平[3]。臨床應(yīng)用小青龍湯治療哮喘的療效也比較顯著，但是由于中藥多成份、多靶點(diǎn)等原因，目前小青龍湯治療哮喘的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全被闡明。系統(tǒng)藥理學(xué)具有“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用的特點(diǎn)，從系統(tǒng)藥理學(xué)角度對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行分析，其機(jī)理可能正是由于通過(guò)配伍藥物之間相互協(xié)作、藥物及其配體之間相互作用這一復(fù)雜關(guān)系網(wǎng)中的節(jié)點(diǎn)相互制約，從而使中藥復(fù)方能有效打擊疾病相關(guān)節(jié)點(diǎn)，保護(hù)整體網(wǎng)絡(luò)平衡[4]。分子對(duì)接是一個(gè)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合模式和結(jié)合自由能的強(qiáng)有力的計(jì)算工具,可以預(yù)測(cè)給定的蛋白質(zhì)和配體(蛋白質(zhì)、DNA/RNA、小分子)的結(jié)合模式及結(jié)合自由能,進(jìn)而對(duì)其功能及作用機(jī)制進(jìn)行研究[5]。本研究利用系統(tǒng)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，對(duì)小青龍湯的主要作用成分及作用靶點(diǎn)進(jìn)行遴選，挖掘哮喘已知的相關(guān)靶點(diǎn)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾吧镄畔W(xué)分析小青龍湯治療哮喘的潛在作用機(jī)制，為小青龍湯治療哮喘的進(jìn)一步探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 小青龍湯的化學(xué)成分收集

本研究構(gòu)建小青龍湯化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)采用的是TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/)，借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索小青龍湯全方的所有化學(xué)成分，以建議藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%[6]。高口服生物利用度常常是決定生物活性分子作為治療劑的類(lèi)藥性的關(guān)鍵指標(biāo)。類(lèi)藥性(drug—likeness，DL)≥0.18[7]。篩選并得到小青龍湯中的活性成分。

1.2 小青龍湯化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

將小青龍湯中8味藥物中相應(yīng)的化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)以Mol2的格式上傳PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)[8-10](http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php)，篩選剔除重復(fù)靶點(diǎn)。并將小青龍湯化合物潛在靶點(diǎn)信息錄入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中檢索篩選物種為人源的靶點(diǎn)作為小青龍湯作用于哮喘的有效作用靶點(diǎn)。

1.3 小青龍湯化學(xué)成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了說(shuō)明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)上的作用，將1.2所得的小青龍湯潛在靶點(diǎn)信息上傳STRING 10.5在線軟件(http://string-db.org)，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。將從STRING數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1(http://www.Cytoscape.org/)軟件進(jìn)行可視化分析，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)網(wǎng)絡(luò)分析。進(jìn)一步設(shè)置以Degree值大小體現(xiàn)顏色與節(jié)點(diǎn)大小，以邊的顏色粗細(xì)反映Combined score大小，最終獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 小青龍湯化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

每個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)是基因、蛋白質(zhì)或分子，而節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接(edge)則代表著這些生物分子之間的相互作用[11]。選取小青龍湯每個(gè)有效化合物成分前10個(gè)靶點(diǎn)，將化合物及靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析處理，計(jì)算其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)并構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建

本研究基于TTD及Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)綜合篩選哮喘相關(guān)靶點(diǎn)，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)提供關(guān)于耐藥性突變的對(duì)目標(biāo)和藥物基因表達(dá)和目標(biāo)組合的數(shù)據(jù)庫(kù)[12]，經(jīng)兩大數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘共同篩選哮喘相關(guān)基因。利用Venn分析工具，將兩者與小青龍湯潛在靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 生物信息學(xué)GO分析及信號(hào)通路富集分析

利用David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)上傳小青龍湯對(duì)哮喘作用靶點(diǎn)的Gene Symbol格式，進(jìn)行GO的生物學(xué)過(guò)程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)功能富集分析；同時(shí)利用David數(shù)據(jù)庫(kù)利用KEGG信號(hào)通路分析,綜合預(yù)測(cè)小青龍湯與哮喘關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。并且利用計(jì)算公式:

計(jì)算出富集因子，并繪制氣泡圖。

1.7 網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)特性拓?fù)鋵W(xué)分析

運(yùn)用Cytoscape 3.6.1軟件中工具Network Analyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)。本研究基于以下參數(shù)：平均最短路徑(average shortest path length，ASPL)、介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)、中心接近度(closeness centrality，CC)、聚類(lèi)系數(shù)(clustering coefficient，CC)、連通度(degree)評(píng)估節(jié)點(diǎn)在全網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.8 主要活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

iGEMDOCK是通過(guò)基于對(duì)接位姿(蛋白質(zhì)-配體相互作用)和化合物性質(zhì)(即原子組成)使用k-均值和分層聚類(lèi)方法提供后分析工具。iGEMDOCK一般用于活性篩選和快速對(duì)接。其結(jié)果以能量的高低去判斷與化合物結(jié)合程度，一般化合物分子與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生的作用可能性越大。在PDB(https://www.rcsb.org/)中搜索小青龍湯作用于哮喘的靶點(diǎn)名稱(chēng)并保存為pdb格式。配體以1.7中通過(guò)計(jì)算拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)得到的degree排名前五類(lèi)的化合物以MOL2格式上傳。

2 結(jié)果

2.1 有效成分篩選

共搜集了1 534個(gè)化合物，其中麻黃363個(gè)、桂枝220個(gè)、白芍85個(gè)、半夏116個(gè)、北五味子130個(gè)、細(xì)辛192個(gè)、干姜148個(gè)、甘草280個(gè)。根據(jù)OB和DL值篩選后最后得到麻黃23個(gè)、桂枝7個(gè)、白芍13個(gè)、半夏13個(gè)、北五味子8個(gè)、細(xì)辛8個(gè)、干姜5個(gè)、甘草92個(gè)化合物?；衔锇ǎ焊什荽?glycyrol)、芍藥苷酮(paeoniflorgenone)、異鼠李素(isorhamnetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、紫杉醇(licopyranocoumarin)等，各個(gè)活性成分的OB和DL值見(jiàn)表1。

表1 小青龍湯化學(xué)成分表Table 1 Xiaoqinglongtang chemical composition table

續(xù)表1(Continued Tab.1)

化合物代碼 Compound code相關(guān)化合物Related compound口服利用度 OB藥物相似性DL藥物DrugMOL002501[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate62.520.31EMOL004835Glypallichalcone61.60.19AMOL004907Glyzaglabrin61.070.35AMOL001736(-)-taxifolin60.510.27DMOL005000Gancaonin G60.440.39AMOL004824(2S)-6-(2,4-dihydroxyphenyl)-2-(2-hydroxypropan-2-yl)-4-methoxy-2,3-dihydrofuro[3,2-g]chromen-7-one60.250.63AMOL0048493-(2,4-dihydroxyphenyl)-8-(1,1-dimethylprop-2-enyl)-7-hydroxy-5-methoxy-couMarin59.620.43AMOL004328Naringenin59.290.21AMOL004328Naringenin59.290.21CMOL005003Licoagrocarpin58.810.58AMOL0048388-(6-hydroxy-2-benzofuranyl)-2,2-dimethyl-5-chromenol58.440.38AMOL010788Leucopelargonidin57.970.24CMOL004576Taxifolin57.840.27CMOL004576Taxifolin57.840.27DMOL005012Licoagroisoflavone57.280.49AMOL001558Sesamin56.550.83EMOL000211Mairin55.380.78AMOL000211Mairin55.380.78BMOL005018Xambioona54.850.87AMOL000492(+)-catechin54.830.24CMOL000492(+)-catechin54.830.24D

注：根據(jù)OB值降序排列，列出前50個(gè)化學(xué)成分。A：甘草；B：白芍；C：麻黃；：D：桂枝；E：細(xì)辛；F：干姜。

Note:Only the top 50 components are listed according to OB sort.A:licorice;B:white peony;C:ephedra;D:cassia twig;E:asarum;F:dried ginger.

2.2 小青龍湯化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相互作用

PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)計(jì)算的潛在靶點(diǎn)是根據(jù)匹配度(fit score)由高到低進(jìn)行排序。選取每個(gè)化學(xué)成分的前十個(gè)蛋白，共1 690個(gè)，進(jìn)行下一步研究。將相同的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選剔除，結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)及轉(zhuǎn)換，最終共得到167個(gè)靶點(diǎn)，其中包括ETS1、GPI、DRAP1、XRN2、RAC1、UNC45A、CDCA8、SLC5A4、NR1D2、MDM2、MARS等。Network analysis發(fā)現(xiàn),根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的網(wǎng)絡(luò)度(degree)越大,說(shuō)明小青龍湯通過(guò)該靶點(diǎn)治療疾病的可能性越大，具體拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。其中介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)表達(dá)詳見(jiàn)圖1。靶點(diǎn)相互作用關(guān)系圖詳見(jiàn)圖2其節(jié)點(diǎn)大小、顏色由拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中網(wǎng)絡(luò)度決定。

2.3 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)構(gòu)建及比對(duì)分析

在TTD、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)的藥物治療性靶點(diǎn)有100個(gè)，與小青龍湯潛在靶點(diǎn)有3個(gè)重合；經(jīng)Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)初步篩選出3 949個(gè)候選基因，根據(jù)“Relevance score”度取相關(guān)度最高的前300個(gè)結(jié)果，其中與小青龍湯靶點(diǎn)有11個(gè)重合。經(jīng)合并數(shù)據(jù)庫(kù)法查詢(xún)共篩選出381個(gè)哮喘高度相關(guān)性靶點(diǎn)，與小青龍湯有13個(gè)重疊靶點(diǎn)，其韋恩圖表達(dá)詳見(jiàn)圖3。

圖1 小青龍湯化合物-靶點(diǎn)圖拓?fù)鋵W(xué)介數(shù)中心性Fig.1 Xiaoqinglong decoction compound-target map topology

表2 小青龍湯化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Table 2 Topological parameters of chemical constituents of Xiaoqinglong decoction

圖2 小青龍湯的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network diagram of Xiaoqinglong decoction.

2.4 小青龍湯主要活性成分對(duì)哮喘作用靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析

利用David數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析的結(jié)果富集出43個(gè)生物學(xué)過(guò)程其中包括蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of protein phosphorylation)、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of gene expression)、T細(xì)胞共刺激(T cell costimulation)等。

圖3 小青龍湯作用靶點(diǎn)與哮喘靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of Xiaoqinglong decoction using target and asthma target

蛋白質(zhì)磷酸化是細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等細(xì)胞內(nèi)過(guò)程的重要構(gòu)成因素。11個(gè)細(xì)胞組成其中包括細(xì)胞外泌體(extracellular exosome)、線粒體基質(zhì)(mitochondrial matrix)、局灶性粘連(focaladhesion)等和9個(gè)分子功能其中包括蛋白激酶結(jié)合(protein kinase binding)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、ATP結(jié)合(ATP binding)等。具體分類(lèi)見(jiàn)圖4。KEGG分析得到29條信號(hào)通路；其中包括PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、FXO信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等，KEGG分析結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

iGEMDOCK分子對(duì)接iGEMDOCK 分子對(duì)接結(jié)果將小青龍湯作用于哮喘的13個(gè)潛在靶點(diǎn)與小青龍湯中的經(jīng)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)計(jì)算主要的五類(lèi)化合物beta-sitosterol、sitosterol、kaempferol、24-Ethylcholest-4-en-3-one[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] 、(1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate進(jìn)行分子對(duì)接，配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)能量越低發(fā)生的作用可能性越大，其結(jié)合力具體參數(shù)見(jiàn)圖5；具體分子對(duì)接結(jié)果，見(jiàn)表4。其中結(jié)合性最強(qiáng)的是GSR與[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-7-carboxylate，其具體對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖4 小青龍湯對(duì)哮喘作用靶點(diǎn)的GO分析的結(jié)果Fig.4 Results of GO analysis of Xiaoqinglong decoction on asthma target.

圖5 小青龍湯主要化學(xué)成分和具體靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Fig.5 Main chemical constituents and specific target docking results of Xiaoqinglong decoction

表3 小青龍湯對(duì)哮喘作用靶點(diǎn)的KEGG分析的結(jié)果Table 3 Results of KEGG analysis of Xiaoqinglong decoction on asthma target

續(xù)表3(Continued Tab.3)

信號(hào)通路Signal pathway基因名稱(chēng)Gene name-LgP甲狀腺激素信號(hào)通路Thyroid hormone signaling pathwayPDPK1,CREBBP,TP53,MDM2,MTOR4.5膠質(zhì)瘤GliomaTP53,MDM2,MTOR,EGF3.78HIF-1信號(hào)通路HIF-1 signaling pathwayEIF4E,CREBBP,MTOR,EGF3.26癌癥中的膽堿代謝Choline metabolism in cancerPDPK1,RAC1,MTOR,EGF3.22鞘脂信號(hào)通路Sphingolipid signaling pathwayPDPK1,ROCK2,RAC1,TP533FoxO信號(hào)通路FoxO signaling pathwayPDPK1,CREBBP,MDM2,EGF2.86Wnt信號(hào)通路Wnt signaling pathwayROCK2,CREBBP,RAC1,TP532.82膀胱癌Bladder cancerTP53,MDM2,EGF2.66肌萎縮側(cè)索硬化ALSAmyotrophic lateral sclerosis ALSRAC1,TP53,SOD12.49子宮內(nèi)膜癌Endometrial cancerPDPK1,TP53,EGF2.46非小細(xì)胞肺癌Non-small cell lung cancerPDPK1,TP53,EGF2.39mtor信號(hào)通路mTOR signaling pathwayPDPK1,EIF4E,MTOR2.36病毒致癌Viral carcinogenesisCREBBP,RAC1,TP53,MDM22.33粘著斑Focal adhesionPDPK1,ROCK2,RAC1,EGF2.33肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控Regulation of actin cytoskeletonROCK2,F2,RAC1,EGF2.3胰腺癌Pancreatic cancerRAC1,TP53,EGF2.27黑色素瘤MelanomaTP53,MDM2,EGF2.19癌癥中的MicroRNAsMicroRNAs in cancerCREBBP,TP53,MDM2,MTOR1.94神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路Neurotrophin signaling pathwayPDPK1,RAC1,TP531.75細(xì)胞周期Cell cycleCREBBP,TP53,MDM21.73丙型肝炎Hepatitis CPDPK1,TP53,EGF1.67胰島素信號(hào)通路Insulin signaling pathwayPDPK1,EIF4E,MTOR1.64愛(ài)潑斯坦巴爾病毒感染Epstein-Barr virus infectionCREBBP,TP53,MDM21.38亨廷頓氏病Huntington's diseaseCREBBP,TP53,SOD11.37cAMP信號(hào)通路cAMP signaling pathwayROCK2,CREBBP,RAC11.35

表4 小青龍湯主要活性成分-作用靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Table 4 The main active ingredient of Xiaoqinglong decoction-the molecular docking result of the target

續(xù)表4(Continued Tab.4)

靶點(diǎn)名稱(chēng)Target namePDB ID化合物Compound分子對(duì)接得分Molecular dockingSOD11UXL[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-2-carboxylate-93.1844ROCK24L6Qβ-sitosterol-82.2422ROCK24L6QSitosterol-88.8998ROCK24L6QKaempferol-80.1915ROCK24L6Q24-Ethylcholest-4-en-13-one-82.3017ROCK24L6Q[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-11-carboxylate-87.5071RAC12H7Vβ-sitosterol-95.1734RAC12H7VSitosterol-94.6386RAC12H7VKaempferol-98.1151RAC12H7V24-Ethylcholest-4-en-6-one-95.9319RAC12H7V[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-4-carboxylate-104.737PDPK11W1Hβ-sitosterol-68.4275PDPK11W1HSitosterol-69.1211PDPK11W1HKaempferol-65.2296PDPK11W1H24-Ethylcholest-4-en-5-one-68.6266PDPK11W1H[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-3-carboxylate-71.7119MTOR4JSVβ-sitosterol-89.4241MTOR4JSVSitosterol-86.6296MTOR4JSVKaempferol-91.8557MTOR4JSV24-Ethylcholest-4-en-12-one-81.8009MTOR4JSV[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-10-carboxylate-88.0765MMP145OM3β-sitosterol-66.3335MMP145OM3Sitosterol-60.0399MMP145OM3Kaempferol-68.2973MMP145OM324-Ethylcholest-4-en-14-one-63.7437MMP145OM3[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-12-carboxylate-81.2716MDM24JRGβ-sitosterol-91.6804MDM24JRGSitosterol-91.2105MDM24JRGKaempferol-75.2285MDM24JRG24-Ethylcholest-4-en-11-one-88.2961MDM24JRG[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-9-carboxylate-80.641GSR3DJGβ-sitosterol-120.577GSR3DJGSitosterol-112.06GSR3DJGKaempferol-123.186GSR3DJG24-Ethylcholest-4-en-9-one-114.148GSR3DJG[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-7-carboxylate-124.458F22KXDβ-sitosterol-89.2748F22KXDSitosterol-99.0496F22KXDKaempferol-92.6111

續(xù)表4(Continued Tab.4)

靶點(diǎn)名稱(chēng)Target namePDB ID化合物Compound分子對(duì)接得分Molecular dockingF22KXD24-Ethylcholest-4-en-7-one-103.611F22KXD[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-5-carboxylate-83.7111EIF4E5BXVβ-sitosterol-102.627EIF4E5BXVSitosterol-101.004EIF4E5BXVKaempferol-112.228EIF4E5BXV24-Ethylcholest-4-en-15-one-103.53EIF4E5BXV[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-13-carboxylate-102.656EGF1NQLβ-sitosterol-85.4722EGF1NQLSitosterol-97.5038EGF1NQLKaempferol-86.5662EGF1NQL24-Ethylcholest-4-en-3-one-80.6163EGF1NQL[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-1-carboxylate-83.7145CREBBP3DWYβ-sitosterol-96.6545CREBBP3DWYSitosterol-89.6597CREBBP3DWYKaempferol-86.0653CREBBP3DWY24-Ethylcholest-4-en-10-one-87.3514CREBBP3DWY[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl-4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl-3-oxoprop-1-enyl]-2,2-dimethylcyclopropane-8-carboxylate-85.2097

圖6 GSR與[(1S)-3-[(E)-but-2-enyl]-2-methyl- 4-oxo-1-cyclopent-2-enyl] (1R,3R)-3-[(E)-3-methoxy-2-methyl- 3-oxoprop-1-enyl]-2,2- dimethylcyclopropane-7-carboxylate分子對(duì)接結(jié)果 Fig.1 GSR and [(1S)-3-[(E)-but-2-eny1]- 2-methy1-4-oxo-1-cyclopent-2-eny1] [(1R,3R)-3-[(E)-3]-Methoxy-2-methy1- 3-oxoprop-1-eny1]-2,2-dimethylcyclopropane- 7-carboxylate docking results.

3 討論

哮喘是世界上最常見(jiàn)的慢性疾病之一，是復(fù)雜的、多基因遺傳傾向的疾病。哮喘的發(fā)病機(jī)制與炎癥機(jī)制、神經(jīng)調(diào)節(jié)等機(jī)制相關(guān)。目前主流治療方式仍是以糖皮質(zhì)激素、支氣管舒張劑等西藥治療，它可作用于大多數(shù)炎癥細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞。但是由于長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素可產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，雖然糖皮質(zhì)激素有較好的療效，但并不能從根本上解決疾病的發(fā)病和進(jìn)展，因此積極尋找新的治療藥物和手段十分重要[13]。中醫(yī)學(xué)對(duì)“咳嗽”“哮喘”有悠久而豐富的的治療經(jīng)驗(yàn)，能顯著降低哮喘患者的發(fā)病次數(shù)提高患者生活質(zhì)量，同時(shí)中醫(yī)綜合療法的不良反應(yīng)發(fā)生率低，具有極高的臨床安全性[14]。小青龍湯方中麻黃含甘露糖、氨基葡萄糖、氨基甘露糖等具有重要的免疫抑制作用[15]，可憑借細(xì)辛的揮發(fā)油成分解除氣管痙攣，進(jìn)而有效治療痰濁阻肺證、外寒內(nèi)飲，并且針對(duì)痰濕水氣凝于腎肺的癥狀也可明顯改善，半夏具有抑制腺體分泌、鎮(zhèn)咳的作用。但是中藥方劑具有“多因、多效、多靶點(diǎn)”各個(gè)成分協(xié)同起效的作用，所以其具體分子機(jī)制難以被闡明。本研究基于分子對(duì)接模擬小分子配體與受體生物大分子相互作用、生物信息學(xué)分析結(jié)合系統(tǒng)藥理學(xué)的角度對(duì)小青龍湯治療哮喘的具體分子機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)進(jìn)而對(duì)小青龍湯治療哮喘做出科學(xué)詮釋。

在化合物篩選中，部分關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性。例如：異甘草素(isoliquiritigenin)、黃芩苷(Baicalin)、芍藥苷(paeoniflorin)等，覃月穆[16]等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化,抑制NF-κB p65入核使其不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,最終影響其下游凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2，從而控制細(xì)胞凋亡。在小鼠哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中表明[17]，在小鼠哮喘模型中槲皮素能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，可以抑制Gata-3表達(dá)增加T-bet表達(dá)，改變Th1/Th2極化，從而達(dá)到降低氣道變應(yīng)性炎癥和氣道高反應(yīng)性的目的。在大鼠放射性肺損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，黃芩苷干預(yù)后明顯降低了放射性肺損傷大鼠血清中TGF-β1、IL6 和TNF-α的含量，證明中藥黃芩苷對(duì)促炎性因子具有一定的抑制作用，對(duì)放射性肺損傷具有一定的保護(hù)作用可以在一定程度上減輕肺損傷[18]。芍藥苷可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、激活PI3K/AKT和IκBα/NF-κB信號(hào)通路抑制MRL/1pr狼瘡鼠的肺部炎癥[19]。在化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中ETS1、GPI、DRAP1、XRN2、RAC1、UNC45A、CDCA8等靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)計(jì)算中占重要作用，這些靶點(diǎn)與血管生成參與傷口愈合來(lái)源、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、免疫反應(yīng)來(lái)源、炎癥反應(yīng)等過(guò)程有關(guān)，并且存在著多重協(xié)同效應(yīng)。

對(duì)小青龍湯的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與多種炎癥反應(yīng)、糖酵解、免疫調(diào)節(jié)緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如：SOD、GPI、RAC1等。因此我們對(duì)小青龍湯作用于哮喘的13個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。在GO分析中發(fā)現(xiàn)小青龍湯可以對(duì)蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)、血小板活化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、肺發(fā)育等生物過(guò)程起調(diào)控作用。SOD1、MTOR、TP53等多個(gè)靶點(diǎn)在被富集出的重要生物學(xué)過(guò)程中協(xié)同起效。在KEGG分析的過(guò)程中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、HIF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究與哮喘的關(guān)系密切。其中在哮喘小鼠實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)阻斷 PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)減少嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞在肺組織浸潤(rùn)，可以抑制杯狀細(xì)胞增生引起的黏液高分泌，減少氣道高反應(yīng)，并阻止氣道結(jié)構(gòu)改變[20]。黃革等[22]，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Epac作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的cAMP下游信號(hào)分子，Epac抑制劑對(duì)氣道黏膜杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原沉積和氣道平滑肌增生等重塑過(guò)程均具有明顯促進(jìn)作用，提示Epac對(duì)徑可能對(duì)慢性哮喘氣道重塑過(guò)程有一定保護(hù)作用。

臨床應(yīng)用小青龍湯湯治療哮喘大大改善了患者的生活質(zhì)量，減輕糖皮質(zhì)激素使用引起的毒副反應(yīng)，提高了疾病控制率。本研究基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法，初步探究了小青龍湯治療哮喘的復(fù)雜機(jī)制過(guò)程，為后續(xù)從小青龍湯湯中提取有效藥物成分治療哮喘提供了科學(xué)理論基礎(chǔ)，也對(duì)論證中藥復(fù)方的科學(xué)性提供了參考。但是隨著對(duì)中藥復(fù)方認(rèn)識(shí)的不斷深入我們逐漸認(rèn)識(shí)到由于中藥成分復(fù)雜等多種原因，基于系統(tǒng)藥理學(xué)和生物信息學(xué)對(duì)小青龍湯的認(rèn)識(shí)仍存在很多不足，例如：小青龍湯可能通過(guò)藥物中的小分子多肽、外泌體miRNA調(diào)節(jié)腸道菌群等對(duì)哮喘間接起到調(diào)控作用。因此對(duì)小青龍湯對(duì)哮喘的間接作用的研究以及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證或?qū)⒊蔀橄乱徊窖芯康闹匾獌?nèi)容。