李效寬，黃瑞麗，閆曦月，朱津瑞，楊光忠

(中南民族大學(xué) 民族藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，武漢 430074)

膽酸鈉是自豬、牛、羊等動物膽汁中提取的膽汁酸鹽的混合物[1]，為淡黃色或棕黃色粉末，具有鎮(zhèn)咳、平喘等功效[2-4]，在臨床上應(yīng)用廣泛. 膽酸鈉生產(chǎn)一般采用膽紅素、膽酸鈉聯(lián)產(chǎn)工藝，即將豬膽汁加入飽和石灰水加熱煮沸，分出膽鈣鹽，用以制取膽紅素母液(豬膽汁水)以鹽酸水解，析出的粗膽酸經(jīng)干燥后，以6倍量乙醇溶解，再加入飽和氫氧化鈉的乙醇溶液，使之反應(yīng)成鈉鹽，經(jīng)過脫色、回流、過濾、蒸餾、濃縮、真空干燥等工序得膽酸鈉原粉.但工藝所用乙醇和乙醚有機溶劑對人體有害，在產(chǎn)品中的殘留須加以控制.原國家膽酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5]中無殘留溶劑的檢查，不利于該品種質(zhì)量的控制.國內(nèi)外學(xué)者對膽酸鈉的研究主要在其溶解度與被吸附的難易程度上或提取工藝上的研究，或是對其藥理活性和作用上及其它方面的研究，較少涉及到對膽酸鈉原料藥的質(zhì)量控制上[6-8]，本文旨在建立定量測定膽酸鈉原料中溶劑殘留的方法，以對其進行有效檢測和控制，為膽酸鈉殘留溶劑標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 材料和儀器

乙腈(Sigma，色譜純)；二次蒸餾水(UPH-I-10T，成都優(yōu)普電子產(chǎn)品)；乙醇對照品(201610502，中國藥品生物制品檢定所)；乙醚對照品(201510401，中國藥品生物制品檢定所)；膽酸鈉樣品(批號401, 402, 403).

氣相色譜儀(6890N型, 美國安捷倫, FID檢測器)；1.0 μL進樣針，HP-INNO Wax氣相毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm, 美國安捷倫)；氫氣發(fā)生器(CH-1型，武漢科林普豐儀器)；靜音無油空氣泵(CA-1型，武漢科林普豐儀器)；電子分析天平(EX125ZH，1/105，奧豪斯儀器)；數(shù)據(jù)分析軟件(Chemstations 32色譜工作站).

1.2 色譜分析條件

色譜條件：以氮氣為載氣，流速為1.5 mL·min-1，不分流，進樣量為0.5 μL，空氣流量400 mL·min-1，氫氣流量40 mL·min-1，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度250 ℃，色譜柱溫度為50 ℃.

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液的制備

精密稱取乙醚31.62 mg，乙醇31.05 mg于5 mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻；精密量取1 mL于25 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，作為混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

精密稱定約2.0 g膽酸鈉樣品(取平行樣各2份)于25 mL容量瓶中，用適量乙腈溶解并超聲20 min，放冷，用乙腈定容，搖勻，再用微孔濾膜過濾，作為供試品溶液.

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

分別取乙醇29.70 mg和乙醚31.30 mg于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成乙醇、乙醚單標(biāo)溶液.按上述色譜條件，分別進樣空白溶液(乙腈)、單標(biāo)溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液，記錄并分析色譜圖(見圖1).由圖1可見：乙腈溶劑色譜圖峰對乙醇、乙醚色譜峰不產(chǎn)生干擾，而且乙醇、乙醚色譜峰峰型對稱，分離良好，分離度大于1.5，同其溶劑及雜質(zhì)峰也分離良好，樣品色譜圖分離良好.

1)溶劑(乙腈)；2)乙醚；3)乙醇圖1 空白溶劑(a)、乙醚標(biāo)準(zhǔn)品(b)、乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(c)、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(d)和樣品溶液(e)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank solvent(a), standard ether(b), standard ethanol(c), mixed standard solution(d) and sample solution(e)

2.2 線性關(guān)系考察

分別取乙醇對照品33.26 mg和乙醚對照品39.34 mg混合于25 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制成含乙醇1.3304 mg·mL-1和乙醚1.5736 mg·mL-1的混合溶液，作為線性儲備液.分別精密量取線性儲備液0.5，1，2，3，5 mL置于10 mL容量瓶中，用乙腈依次稀釋成系列對照品溶液，分別進樣0.5 μL，以進樣量濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，得出乙醇和乙醚的線性回歸方程分別為A=309.23c+11.242,r=0.9976；A=373.89c+5.2939,r=0.9982.說明乙醇在66.5～665.2 μg·mL-1范圍內(nèi)，乙醚在78.7～786.8 μg·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.

2.3 精密度實驗

取乙醇、乙醚對照品溶液(乙醇濃度266.1 μg·mL-1，乙醚濃度314.7 μg·mL-1)，照上述色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖及峰面積，經(jīng)計算，乙醇和乙醚峰面積的RSD分別為1.31%和1.25%，表明此法的精密度較好.

2.4 加樣回收率實驗

在已測定乙醇、乙醚含量的膽酸鈉原料中分別取6份，準(zhǔn)確加入已知的乙醇、乙醚，按照上述方法制備供試品溶液，在相同的條件下進行測定，乙醇回收率為100.18%，乙醚回收率為101.02%.結(jié)果表明：2種溶劑的回收率好，方法準(zhǔn)確可靠.

2.5 樣品含量測定

按照上述供試品溶液的制備方法制備3批樣品溶液(批號401, 402, 403)，并按照上述色譜條件測定供試品中乙醇和乙醚的含量(n=3)，乙醇、乙醚的百分含量分別為0.7, 0.9, 0.6 mg·g-1和30, 40, 30 μg·g-1(色譜結(jié)果見圖1).

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果分析

依照標(biāo)準(zhǔn)測定方法，按外標(biāo)法計算樣品中溶劑的殘留量，根據(jù)《中國藥典》2015 年版二部附錄Ⅷ P 第一法，殘留溶劑測定法及ICH 的規(guī)定，本品中的待測溶劑乙醇和乙醚為3類溶劑，按規(guī)定：乙醚和乙醇均不得超過5 mg·g-1.本法測定中乙醚和乙醇殘留量均符合藥典要求.

3.2 色譜條件的選擇和優(yōu)化

在色譜柱的選擇上[9]，選用HP-INNO Wax氣相毛細管柱，發(fā)現(xiàn)其具有重現(xiàn)性好、柱效高、峰形尖銳、信噪比低等優(yōu)點.在溶劑的選擇上，使用甲醇作為溶劑，其溶劑峰會對乙醚、乙醇的出峰情況造成干擾，不利于定量定性分析；而以乙腈為溶劑，對色譜柱的影響較小，分離效果較佳，重復(fù)性較好，最為理想.

3.3 膽酸鈉標(biāo)準(zhǔn)的提高

工藝過程中所使用的乙醇和乙醚有機溶劑對人體有害，其在產(chǎn)品中的殘留須加以控制.受檢查技術(shù)和檢查儀器所限，原國家膽酸鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無殘留溶劑的檢查，不利于該品種質(zhì)量的控制，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量對人體健康有隱患.本文有效地建立了定量測定膽酸鈉原料中溶劑殘留的方法，為建立膽酸鈉殘留溶劑標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，能有效檢測膽酸鈉原料中有機溶劑殘留.