羅 敏 肖婷婷 曾 星 張 嫻

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510120)

甘草酸(Glycyrrhizic acid，GA)又名甘草甜素，是豆科植物甘草根部提取物中最主要的活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明甘草酸具有抗炎、抗?jié)?、抗過敏、抗氧化、皮質(zhì)激素樣作用等生物學(xué)特性[1]。研究發(fā)現(xiàn)甘草酸對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞IEC-6炎癥模型具有潛在的保護作用，其抗炎機制可能與抑制炎癥因子釋放和干預(yù)炎癥信號通路密切相關(guān)[2，3]。既往研究表明，甘草酸能夠調(diào)節(jié)LPS刺激的IEC-6細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)，減輕該細(xì)胞的炎癥性損傷，具有一定的抗炎作用[4]。在此，通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞炎癥模型，進(jìn)一步觀察甘草酸對LPS誘導(dǎo)活化Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)/NF-κB信號通路的干預(yù)作用，以明確甘草酸抑制IEC-6細(xì)胞炎癥損傷的細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 大鼠IEC-6細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；甘草酸購自Fluka公司；LPS購自Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液購自Gibco公司；RIPA蛋白提取試劑、兔抗NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、環(huán)氧合酶2(Cyclooxygenase 2，COX-2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)抗體購自CST公司；TRIZOL購自Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒和胞漿胞核試劑盒購自Thermo Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自德國Roche公司；5×蛋白上樣緩沖液購自碧云天公司；TLR4、MyD88、GAPDH抗體購自Santa公司；LaminB1、α-tubulin、細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、CD14、IL-6、IL-10抗體購自Proteintech公司；Western blot所用試劑及分子標(biāo)準(zhǔn)購自美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將大鼠的IEC-6細(xì)胞用含10% FBS、0.1 U/ml胰島素的DMEM于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，用0.25%胰酶消化傳代。實驗設(shè)立Control組、LPS組、LPS+GA組、GA組，細(xì)胞接種貼壁后，Control組正常培養(yǎng)，GA組和LPS+GA組加入100 μg/ml的藥物作用24 h后，與LPS組一起加入10 μg/ml的LPS作用4 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞蛋白提取及Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平 按上述細(xì)胞分組處理后收集細(xì)胞，棄上清，用4℃的PBS清洗2次。分別按照RIPA和胞漿胞核蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白、胞漿蛋白及胞核蛋白，BCA法蛋白定量變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)移至PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉以及相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，二抗搖床孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，應(yīng)用成像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描分析結(jié)果。細(xì)胞總蛋白以GAPDH為內(nèi)參，細(xì)胞漿蛋白以α-tubulin為內(nèi)參，核蛋白以LaminB1為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，即可得到目的蛋白與對應(yīng)內(nèi)參蛋白之間的灰度值之比，并進(jìn)行組間比較。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3RT-qPCR檢測mRNA表達(dá) Trizol裂解收集細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行程序擴增，檢測各處理組細(xì)胞內(nèi)TLR4、IL-6、IL-10的mRNA表達(dá)水平，引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中TLR4信號通路相關(guān)膜蛋白分子TLR4、CD14、MyD88蛋白表達(dá)以及IκBα磷酸化的影響 Western blot結(jié)果如圖1所示，與Control組相比，LPS模型組TLR4、CD14、MyD88蛋白表達(dá)和p-IκBα磷酸化水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與LPS模型組相比，LPS+GA組與GA組能顯著逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。

2.2GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響 上述結(jié)果顯示GA可以顯著抑制CD14、TLR4蛋白表達(dá)及IκBα的磷酸化水平，進(jìn)一步檢測NF-κB p65在細(xì)胞漿及細(xì)胞核的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Control組相比，IEC-6細(xì)胞在LPS刺激下，核內(nèi)NF-κB p65蛋白分布顯著增高，明顯高于Control組，GA干預(yù)后可顯著降低其表達(dá)(圖2，P<0.05)。而NF-κB p65總蛋白并沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2，P>0.05)。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of Real-time PCR

圖1 GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中TLR4、CD14、MyD88蛋白表達(dá)以及IκBα磷酸化的影響Fig.1 Effect of GA on expression of TLR4，CD14，MyD88 proteins and phosphorylation of IκBα in LPS-induced TLR4 signaling pathways of IEC-6 cellsNote: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.005，***.P<0.000 1；compared with LPS model group，#.P<0.05，##.P<0.005，###.P<0.000 1.

圖2 GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響Fig.2 Effects of GA on nuclear translocation of NF-κB p65 induced by LPS in IEC-6Note: Compared with Control group， **.P<0.005；compared with LPS model group， ##.P<0.005，###.P<0.000 1.

圖3 GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中ICAM-1、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of GA on mRNA expression of ICAM-1，IL-6 and IL-10 induced by LPS in Note: Compared with Control group，*.P<0.05；compared with LPS model group，#.P<0.05.

圖4 GA對LPS誘導(dǎo)的ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6和IL-10的影響Fig.4 Effect of GA on expression of ICAM-1，COX-2，iNOS，IL-6 and IL-10 induced by LPSNote: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.005，***.P<0.000 1；compared with LPS model group，#.P<0.05，##.P<0.005，###.P<0.000 1.

2.3GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中ICAM-1、IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR 結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)后，IEC-6細(xì)胞中ICAM-1、IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯升高，IL-10 mRNA表達(dá)水平降低，并與Control組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3，P<0.05)。與LPS組相比，GA干預(yù)組ICAM-1、IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著下降，IL-10 mRNA水平升高(圖3，P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4GA對LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6和IL-10蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果如圖4所示，相對于Control組，LPS組ICAM-1、COX-2、iNOS、IL-6蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)以及IL-10的蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，與LPS相比，GA干預(yù)能顯著逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明GA能影響NF-κB信號通路的活化以抑制炎癥基因的表達(dá)。

3 討論

LPS又稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌的致病因子。正常生理情況下，腸道存在精確的負(fù)性調(diào)控機制使得腸上皮細(xì)胞與腸道高濃度的細(xì)菌保持共生狀態(tài)，而在病理狀態(tài)下，大量腸道內(nèi)細(xì)菌和LPS直接接觸腸黏膜上皮細(xì)胞，可引起不同的腸道病理改變和炎癥損傷。CD14是第一個被鑒定為LPS受體的蛋白，通過識別結(jié)合LPS/LPB(LPS binding protein)復(fù)合物來介導(dǎo)LPS的免疫反應(yīng)[5]。TLR4是識別LPS的關(guān)鍵上游受體，控制著LPS炎癥信號的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在典型情況下，TLR4活化后CD14將LPS轉(zhuǎn)移至TLR4/髓樣分化蛋白2(Myeloid differentiation protein 2，MD-2)復(fù)合物中[6]。NF-κB是腸道炎癥和免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通常以二聚體亞基(p65及p50)與其抑制物IκB結(jié)合形成三聚體，并以無活性形式存在于細(xì)胞漿中[7]。TLR4被激活后的自身二聚化與MyD88結(jié)合，誘導(dǎo)IκB激酶即從無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)為活性狀態(tài)，催化IκBα磷酸化降解，釋放的NF-κB暴露出p50 亞基上的易位信號和p65 亞基上的DNA 結(jié)合位點，借助p50由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，借助p65與相應(yīng)靶基因中的啟動子或增強子κB位點結(jié)合，從而誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。

Western blot檢測結(jié)果顯示IEC-6細(xì)胞在LPS刺激后TLR4、CD14、MyD88 和p-IκBα蛋白表達(dá)增高，p65核內(nèi)分布明顯增多，而甘草酸能阻止LPS誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞NF-κB通路的激活，減少p65的核轉(zhuǎn)位。Wang 等[8]報道用甲氨蝶呤誘導(dǎo)的腸炎性大鼠中，甘草酸可通過降低NF-κB p65 和 p38MAPK表達(dá)水平以預(yù)防腸炎發(fā)生。

ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，廣泛參與炎癥和免疫反應(yīng)[9]。ICAM-1在正常腸組織中呈低水平表達(dá)，而在炎癥狀態(tài)下，ICAM-1的表達(dá)水平迅速上調(diào)， NF-κB可以和ICAM-1基因啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相互結(jié)合促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)，這與我們研究結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)甘草酸預(yù)處理能夠顯著降低LPS刺激IEC-6細(xì)胞中ICAM-1的水平，正如Wang等[10]報道甘草酸能夠有效抑制單核細(xì)胞趨化蛋白-1和ICAM-1的表達(dá)，從而在糖尿病小鼠腎臟中發(fā)揮抗糖尿病作用。另外，ICAM-1缺陷小鼠在用3%葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的急性實驗性結(jié)腸炎模型中表現(xiàn)出更低的死亡率，并且炎性細(xì)胞浸潤和腸道損傷減少[11]，這提示ICAM-1可能在急性腸道炎癥的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所以本實驗從另一個角度證實甘草酸可能是通過抑制ICAM-1的表達(dá)而減緩因各種因素造成的腸道炎癥性損傷。iNOS和COX-2是啟動子含NF-κB結(jié)合位點的兩種誘生型酶，也是介導(dǎo)炎癥過程的重要酶。在大多數(shù)正常狀態(tài)下不表達(dá)，而在炎癥時高度表達(dá)，分別催化一氧化氮(Nitric oxide，NO)、前列腺素E2(PGE2)的大量合成?，F(xiàn)有研究表明，真核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB參與調(diào)控iNOS和COX-2的表達(dá)。Zhao等[12]報道甘草酸通過抑制NF-κB信號通路的激活、抑制腎組織中NO和PGE2的產(chǎn)生以及降低iNOS和COX-2的表達(dá)水平，進(jìn)一步緩解敗血癥誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷，顯著提高急性腎損傷大鼠存活率。此外，Wang等[13]研究顯示甘草甜素能夠顯著減弱小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中NF-κB的活化，同時LPS誘導(dǎo)的iNOS和COX-2表達(dá)被甘草甜素抑制，故甘草甜素可發(fā)展為治療子宮內(nèi)膜異位癥的潛在藥劑。此外，已有大量研究表明[14-16]，甘草酸能夠通過干預(yù)多個炎癥信號通路來減少或抑制炎癥因子的釋放，從而減輕LPS所導(dǎo)致的炎癥損傷。本實驗結(jié)果也表明，LPS組中iNOS和COX-2的表達(dá)水平顯著增加，而甘草酸干預(yù)后能夠減弱LPS誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中iNOS和COX-2的表達(dá)。同時本研究結(jié)果顯示甘草酸能抑制促炎性細(xì)胞因子IL-6分泌，增加抗炎性細(xì)胞因子IL-10分泌。

綜上所述，甘草酸能通過抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路的活化以阻斷調(diào)控炎癥因子及相關(guān)蛋白的合成，從而達(dá)到有效抑制LPS所致的腸上皮細(xì)胞炎癥損傷。