王英杰 王 晶

(承德醫(yī)學(xué)院，承德 067000)

胃癌現(xiàn)在已經(jīng)成為全世界都關(guān)注的健康問題，截至目前，胃癌的發(fā)病人數(shù)仍以每年90多萬例的數(shù)量持續(xù)增加，并且每年的死亡人數(shù)也達(dá)到了70多萬例，占據(jù)了全球死亡人數(shù)的第二位[1]，給人們的健康生活以及經(jīng)濟(jì)都帶來了巨大的損失，是消化道最多見的惡性腫瘤。在中國(guó)，其發(fā)病率占消化道惡性腫瘤的首位，約占世界發(fā)病率的52%。針對(duì)胃癌，目前最有效的治療措施就是根治性的切除手術(shù)，但是由于胃癌的早期發(fā)病癥狀并不十分明顯，所以大多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)病情時(shí)就已經(jīng)錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)間。而對(duì)于晚期的胃癌患者，化療是最有效的延長(zhǎng)患者生命的治療手段[2]。所以認(rèn)識(shí)胃癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于胃癌特異性抗癌藥物的研發(fā)和胃癌的治療都具有重要意義。

Notch信號(hào)通路在胃癌的整個(gè)發(fā)生過程中都起到了重要的作用，這其中就包括Notch信號(hào)通路出現(xiàn)表達(dá)升高時(shí)，胃腺上皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大量的增殖，進(jìn)而引起凋亡下降，然后由于上皮表型的惡性轉(zhuǎn)化致使癌變發(fā)生[3]。已有學(xué)者在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Notch的配體Jagged1和人體的侵襲型胃癌具有密不可分的關(guān)系[4]。胃癌組織Jagged1表達(dá)上升的患者的生存率比無Jagged1表達(dá)的患者低[5]。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)NF-κB的過量表達(dá)，能夠造成Notch信號(hào)通路失調(diào)介導(dǎo)，是導(dǎo)致胃癌發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制[6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠胃癌模型，使用替吉奧對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療，檢測(cè)Notch信號(hào)通路的相關(guān)蛋白表達(dá)，為臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)室用動(dòng)物：選用健康的雄性清潔級(jí)大鼠，6～8周齡，重量220～240 g。所有實(shí)驗(yàn)用的大鼠均購于北京維通利華動(dòng)物公司，大鼠取回后能夠自主地進(jìn)食進(jìn)水，動(dòng)物存放室的溫度一般控制在(25±2)℃左右，濕度大約在(40±5)%左右，在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)之前要按照SPF級(jí)的動(dòng)物準(zhǔn)則喂養(yǎng)5～7 d。替吉奧購自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，瓊脂糖和RIPA購自Yeasen公司，β-actin購自Santa cruiz公司，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N′-nitro-N-nitrosog-uanidine,MNNG)購自湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立 用100 μg/ml的MNNG混懸液進(jìn)行灌胃，混懸液里藥品濃度為：2 ml/100 g 體重，每間隔1 d進(jìn)行1次，持續(xù)灌胃30 d，并且每3 d使用1.5 ml的純乙醇強(qiáng)行進(jìn)行灌胃，在進(jìn)食2 d后斷食1 d，在斷食的同時(shí)要保證大鼠自主服用20 mmol/L的脫氧膽酸鈉溶液，每5～7 d 使用夾子擒住大鼠尾部1～2次，這能夠讓大鼠保持一個(gè)相對(duì)亢奮的情緒，每次刺激持續(xù)10 min，連續(xù)進(jìn)行4周；以上的每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均喂養(yǎng)4周。并于制作模型完成之前隨機(jī)選取每組大鼠6只給予胃黏膜的病理形態(tài)學(xué)檢查，在這6只被檢測(cè)鼠中，只要5只大鼠出現(xiàn)有輕、中度的非典型增生，就可以認(rèn)為是制作模型成功。將60只大鼠隨機(jī)取等分為3組：對(duì)照組、模型組、替吉奧治療組。替吉奧治療組給予替吉奧治療，用藥量0.5 mg/g。

1.2.2大鼠胃組織的取材 觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度、攝食及死亡情況。每周稱2次體重，觀察體重變化。給藥第85天，所有大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體重，腹腔注射)麻醉大鼠后，將大鼠的胃取出，然后沿著胃的大彎將胃慢慢剪開，這個(gè)操作的順序是：胃底、胃體、小彎、幽門、賁門處分別取材，4%中性甲醛固定。

1.2.3PCR檢測(cè)Notch1和Jagged1的基因表達(dá) 組織總RNA的提取：取膀胱組織約100 mg，將組織剪碎后放入到勻漿器內(nèi)，加入1 ml預(yù)冷的Trizol，將組織打碎，裝入1.5 ml EP管中；加入300 μl的氯仿，充分混勻，12 000 r/min，4℃離心15 min；抽取上層水樣400 μl轉(zhuǎn)移到清潔的EP管中，加入400 μl異丙醇，12 000 r/min，4℃離心15 min，離心結(jié)束后緩慢將上清倒掉，留取沉淀物；使用預(yù)冷的75%乙醇，清洗1次，然后7 000 r/min，離心5 min；使用無酶槍頭，將75%乙醇吸凈，室溫的狀態(tài)下靜置5～7 min，使乙醇充分揮發(fā)，剩余的沉淀加入25 μl RNase-free水進(jìn)行溶解。

PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系體積為50 μl，反應(yīng)體系內(nèi)容含有：反應(yīng)緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、上下游引物及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA等，其中上下游引物各1 μl，模板cDNA為3 μl。加樣完成后振蕩混勻，瞬時(shí)離心后，置于PCR儀擴(kuò)增。建議反應(yīng)條件為：94℃變性20 s，55℃退火30次，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃延伸30 s。

擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：使用1%瓊脂糖凝膠，用Gelstain染料和凝膠成像系統(tǒng)顯色并采集圖片。使用IPP圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析測(cè)定，測(cè)量條帶灰度值，目的條帶與GAPDH條帶灰度值比值即為該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，引物見表1。

1.2.4Western blot檢測(cè)Notch1、Jagged1的蛋白定量 將獲取的大鼠胃組織從-80℃超低溫冰箱中取出，然后將胃組織剪碎，按照100 mg/ml的比例加入裂解液，12 000 r/min低溫離心15 min，然后SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。5%脫脂奶粉 37℃ 封閉 1.5 h，一抗孵育，并在4℃環(huán)境下過夜，第2天二抗孵育2 h。用ECL顯色液進(jìn)行曝光，使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)大鼠的基本生理數(shù)據(jù) 對(duì)照組中的大鼠進(jìn)食多，肥胖，靈活，毛色光亮；模型組與對(duì)照組相比大鼠出現(xiàn)消瘦，不愛活動(dòng)，毛色灰暗，進(jìn)食少，大便稀溏；替吉奧組大鼠與模型組大鼠相比食量正常，背毛光澤度欠佳，體重增加，大便成形，見表2。

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果 應(yīng)用PCR實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)的結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Notch1和Jagged1 mRNA僅有少量的表達(dá)。與對(duì)照組相比，模型組表達(dá)均上升(P<0.05)。與模型組相比，替吉奧組表達(dá)顯著地下降，但是仍高于對(duì)照組的表達(dá)(P<0.05)，見圖1、表3。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

表2 各組大鼠的體重指標(biāo)Tab.2 Body weight of rats in each group

圖1 PCR檢測(cè)各組Notch1和Jagged1的表達(dá)Fig.1 Detection of mRNA expression levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

表3 PCR 檢測(cè)Notch1和Jagged1在各組中的相對(duì)定量表達(dá)Tab.3 Relative expression detection of mRNA levels of Notch1 and Jagged1 in gastric tissue of mice in each group by PCR

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

2.3Western blot檢測(cè)結(jié)果 Notch1的分子量是120 kD，Jagged1的分子量是150 kD。Notch1和Jagged1的Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，在對(duì)照組中，Notch1和Jagged1蛋白僅有微量的基礎(chǔ)表達(dá)，與對(duì)照組相比，模型組的蛋白表達(dá)均顯著地上升(P<0.05)，與模型組相比，替吉奧組的蛋白表達(dá)下降，但是仍高于對(duì)照組的表達(dá)(P<0.05)，見圖2、表4。

圖2 Western blot檢測(cè)各組Notch1、Jagged1的表達(dá)Fig.2 Detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

表4 Western blot 檢測(cè)Notch1和Jagged1在各組中的相對(duì)定量表達(dá)Tab.4 Relative expression detection of Notch1 and Jagged1 protein in gastric tissue of mice in each group by Western blot

Note：Compared with control group,1)P<0.05；compared with model group，2)P<0.05.

3 討論

胃癌的發(fā)病是一個(gè)很復(fù)雜的過程，這其中有細(xì)胞的增殖等方面的參與，是一個(gè)多發(fā)因素共同作用的結(jié)果[7]。平時(shí)不健康的飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌的感染、基因性質(zhì)的改變都會(huì)成為胃癌發(fā)生的誘因。胃癌的發(fā)生發(fā)展是從胃黏膜良性病變向惡性病變逐步演變的過程，也就是說，是由慢性萎縮性胃炎到胃黏膜癌前病變的過程。近年國(guó)內(nèi)外對(duì)胃癌的研究熱度都呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，這也說明人們對(duì)胃癌的重視程度在逐漸地加深[8]。

替吉奧最早是由日本醫(yī)藥公司研制，并于20世紀(jì)末上市[9]。它的適用范圍是胃癌及頭頸部癌。截至目前，替吉奧在日本已經(jīng)是治療晚期胃癌不可或缺的主要力量。替吉奧在2009年才在中國(guó)研發(fā)成功[10]。在替吉奧出現(xiàn)以前，氟脲嘧啶在處理消化道腫瘤過程中占據(jù)主導(dǎo)位置。但是由于其半衰期比較短，這就在很大程度上降低了氟脲嘧啶的抗癌作用效果，因此在臨床實(shí)際使用過程中，通常采用靜脈滴注的方式來延長(zhǎng)氟脲嘧啶的藥效，這一弊端導(dǎo)致氟脲嘧啶在臨床的實(shí)際使用中出現(xiàn)了很大的局限性。針對(duì)這一問題，替吉奧膠囊成為新一代的氟脲嘧啶類口服抗癌藥物，他的出現(xiàn)將完美地彌補(bǔ)氟脲嘧啶半衰期短的弱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)采用體內(nèi)灌胃法建立大鼠胃癌前病變模型，相對(duì)真實(shí)地模擬和還原了胃癌在臨床中的實(shí)際發(fā)病過程。然后將大鼠胃組織從體內(nèi)分離出來，進(jìn)行蛋白定量和基因方面的檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，治療組Notch1和Jagged1 mRNA的表達(dá)與模型組相比明顯下降，這也表明替吉奧的藥物治療發(fā)揮作用；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，治療組蛋白的表達(dá)相比與模型組顯著地下降，這也進(jìn)一步說明了替吉奧對(duì)胃癌前病變的治療發(fā)揮了作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠的胃癌模型，采用替吉奧進(jìn)行干預(yù)治療，得到了顯著的治療效果，為臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)以及理論依據(jù)。