陳朝豐 于波 呂超 劉曉云 胡小平

北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518036

指（趾）甲是由外胚層分化而來(lái)的皮膚附屬結(jié)構(gòu)，對(duì)肢端具有保護(hù)、可協(xié)調(diào)完成精細(xì)動(dòng)作等作用［1］。在胚胎第20周，甲單位發(fā)育完成［2］。甲板外觀主要受甲母質(zhì)細(xì)胞的特殊分化功能決定。目前關(guān)于甲器官的研究已取得一定的進(jìn)展。如甲干細(xì)胞的識(shí)別［3］、甲器官分化和內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)信號(hào)通路的研究［4］、甲干細(xì)胞再生潛能的探索［5］等，但這些研究基本局限于組織水平或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。因此，建立起人甲母質(zhì)細(xì)胞無(wú)血清原代培養(yǎng)方法，有利于多種甲病機(jī)制的研究及治療方法的探究。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

人甲母質(zhì)組織選自北京大學(xué)深圳醫(yī)院2016年1-12月就診的9 例多指（趾）畸形、要求行指（趾）切除的患者或甲溝炎要求行甲床修整術(shù)的患者，所有行甲床修整術(shù)的患者均為擇期手術(shù)，外用及系統(tǒng)服用抗生素治療甲溝炎，在炎癥消除后再進(jìn)行手術(shù)。本研究通過(guò)北京大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2016025），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

二、主要試劑及儀器

胎牛血清白蛋白、DEME 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）干粉、2.5%胰蛋白酶（美國(guó)Thermo 公司），無(wú)血清的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（CnT-07，瑞士CELLnTEC公司），鼠抗人細(xì)胞角蛋白10（K10）單克隆抗體、兔抗人細(xì)胞K5單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），F(xiàn)ITC488 標(biāo)記山羊抗大鼠 IgG 二抗、DyLight 649 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（上海英駿生物技術(shù)有限公司），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的鼠抗人K10抗體（英國(guó)Novus公司），Triton X-100（德國(guó)Sigma公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman公司）。

三、甲母質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代

將手術(shù)中獲得的指（趾）組織拔除甲板，盡量去除甲母質(zhì)區(qū)的表皮及皮下組織，用手術(shù)刀切下遠(yuǎn)離甲床部位的甲母質(zhì)組織，放入含有生理NaCl 溶液的無(wú)菌標(biāo)本瓶中，剩余的廢棄組織由手術(shù)室統(tǒng)一處理。取甲母質(zhì)組織塊用75%乙醇浸泡5 min，PBS沖洗5次，將甲母質(zhì)組織分成約2 mm3的組織塊，放置在60 mm 一次性培養(yǎng)皿中，每塊組織塊間隔2 cm，用無(wú)菌移液槍頭輕壓組織塊，使其與塑料培養(yǎng)皿充分接觸5 min。待組織塊與皿底充分粘合后，加入2 ml 無(wú)血清DEME/F-12 培養(yǎng)基，浸沒(méi)組織塊。培養(yǎng)皿放置在37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察組織塊邊緣的細(xì)胞增長(zhǎng)情況，培養(yǎng)5～7 d后換用無(wú)血清的角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)（CnT-07）培養(yǎng)基，2～3 d換液1次。原代單層細(xì)胞增長(zhǎng)達(dá)60%～70%時(shí)，用含0.25%胰蛋白酶、0.03%EDTA 的PBS 消化，制備單細(xì)胞懸液用于傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中采用倒置顯微觀察細(xì)胞形態(tài)。單細(xì)胞懸液的最終密度為5×106/ml～1×107/ml時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剩余細(xì)胞與含10%二甲基亞砜的胎牛血清凍存培養(yǎng)液1∶1 混合，分裝在凍存管中，每管1.5 ml，置于-80 ℃冰箱中保存。

四、免疫熒光觀察細(xì)胞角蛋白的表達(dá)情況

將單細(xì)胞懸液均勻接種到放置有15 mm 蓋玻片的12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%去除培養(yǎng)液，PBS浸洗3次。用4%甲醛溶液固定15 min，PBS浸洗3次，用0.5%Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min，PBS 浸洗3 次，滴加1%牛血清白蛋白（BSA），37 ℃封閉30 min，加入K10 抗體和K5 抗體，放入濕盒于4 ℃孵育過(guò)夜。加入熒光二抗（FITC488標(biāo)記山羊抗大鼠IgG二抗、DyLight649標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，1∶100），室溫濕盒中孵育2 h；滴加4，6二氨基-2-2苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行核染，避光孵育5 min；PBS 浸洗玻片3 次，加入含抗熒光猝滅劑的封片液，中性樹(shù)膠封片，在熒光倒置顯微鏡下采集圖像及判定結(jié)果。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)甲母質(zhì)細(xì)胞的純度

取 1 × 106/ml 的單細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），去除上清液，加入50 μl 1%的鼠抗人K10單克隆抗體混勻，4 ℃孵育30 min，PBS 清洗細(xì)胞，1 000 r/min 離心 5 min（離心半徑15 cm），棄上清液，加入50 μl 1%的FITC488 標(biāo)記山羊抗大鼠IgG 二抗混勻，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞后，用細(xì)胞濾膜過(guò)濾2次，上機(jī)檢測(cè)。

結(jié) 果

一、原代培養(yǎng)甲母質(zhì)細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

甲母質(zhì)組織塊種植2～3 d后，有少量細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，細(xì)胞形態(tài)小而圓或呈長(zhǎng)梭形；第5～6 天，細(xì)胞繼續(xù)增殖，局部形成小的細(xì)胞團(tuán)塊；第8天時(shí)，最外緣細(xì)胞距離甲母質(zhì)細(xì)胞的距離不斷增大；第10天時(shí)，在甲母質(zhì)組織塊周邊形成了較大的細(xì)胞團(tuán)塊，部分細(xì)胞形態(tài)為上皮樣細(xì)胞，呈鋪路石樣排列，細(xì)胞間緊密連接，也有部分細(xì)胞呈扁平狀，形態(tài)為紡錘形或星形。見(jiàn)圖1。培養(yǎng)2～3 周后，細(xì)胞生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底的70%～80%，呈單層生長(zhǎng)。培養(yǎng)第20天時(shí)，大部分細(xì)胞呈鋪路石樣排列，也可見(jiàn)少量細(xì)胞呈紡錘形或星形，細(xì)胞的體積較大，大部分細(xì)胞的大小可達(dá)50～ 100 μm（圖2）。當(dāng)生長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶底的70%～80%，細(xì)胞密度達(dá)1 ×106～1×107/L時(shí)即可傳代。

二、原代甲母質(zhì)細(xì)胞角蛋白表達(dá)情況

倒置熒光顯微鏡下顯示，K5、K10 均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，K10 為綠色熒光，K5 為紅色熒光，K10 與K5 共染時(shí)為黃色熒光。亦有部分細(xì)胞未見(jiàn)K5、K10。見(jiàn)圖3。

圖1 甲母質(zhì)細(xì)胞原代甲培養(yǎng)第5、8、10天時(shí)顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)（×100） 甲母質(zhì)組織（不規(guī)則陰影部分）邊緣的細(xì)胞團(tuán)塊隨時(shí)間不斷增大，部分細(xì)胞呈鋪路石樣外觀，部分呈紡錘形及星形

圖2 共聚焦顯微鏡下原代甲母質(zhì)細(xì)胞的基本形態(tài) 少量細(xì)胞呈紡錘形或星形，細(xì)胞的體積較大，大部分細(xì)胞的大小可達(dá)50～100 μm。圖中比例尺單位為200 μm

圖3 熒光顯微鏡下原代甲母質(zhì)細(xì)胞角蛋白5（K5）、K10表達(dá)情況 K10為綠色熒光，K5為紅色熒光，K10與K5共染時(shí)為黃色熒光，亦有部分細(xì)胞未表達(dá)K5、K10

三、流式細(xì)胞儀觀察原代甲母質(zhì)細(xì)胞中K10的表達(dá)情況

流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到以K10 為標(biāo)記的陽(yáng)性甲母質(zhì)細(xì)胞的存在，甲母質(zhì)細(xì)胞的比例約37.6%。見(jiàn)圖4。

討 論

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)以角蛋白10（K10）為標(biāo)記的甲母質(zhì)細(xì)胞比例 4A：以生理NaCl 溶液代替FITC488 標(biāo)記山羊抗大鼠IgG二抗作對(duì)照；4B：K10陽(yáng)性的甲母質(zhì)細(xì)胞的比例約37.6%

甲母質(zhì)是甲器官的主要組成部分［6］，可分化形成完全角質(zhì)化的甲板［7］，近端甲母質(zhì)參與甲板表層的形成，而遠(yuǎn)端甲母質(zhì)主要生成甲板深層，中間區(qū)域的甲母質(zhì)生成了甲板的中間層［8］。當(dāng)甲母質(zhì)細(xì)胞受干擾時(shí)，病變可在甲板上表現(xiàn)出來(lái)。建立甲母質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，有利難治療性甲病的研究及臨床治療。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于甲母質(zhì)細(xì)胞原代細(xì)胞的報(bào)道甚少，本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清培養(yǎng)基，可避免血清培養(yǎng)基能為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，但血清培養(yǎng)基的生產(chǎn)存在差異，不能保證批次間的差異，難以保證實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化，無(wú)血清培養(yǎng)基能盡可能地減少以上干擾因素的影響，使細(xì)胞的性能更加一致，功能的評(píng)估更加精確，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。本研究選用無(wú)血清CnT-07作為培養(yǎng)基，細(xì)胞生長(zhǎng)活性高，貼壁狀態(tài)好。因此，認(rèn)為該培養(yǎng)基可用于甲母質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)。

角蛋白可分為軟角蛋白和硬角蛋白，硬角蛋白是組成毛發(fā)及甲的主要結(jié)構(gòu)［9］。根據(jù)凝膠雙向電泳和分子量的差異，將軟角蛋白分為酸性（Ⅰ型）角蛋白和堿性（Ⅱ型）角蛋白［10］。特定的酸性角蛋白和堿性角蛋白是等量配對(duì)分布的，K5、K14 是配對(duì)分布的［11］，主要在復(fù)層鱗狀上皮基底層和毛囊基質(zhì)的角質(zhì)形成細(xì)胞里表達(dá)［3］，K1 和 K10 也是配對(duì)分布，主要存在于正常皮膚的基底層中，與角質(zhì)形成細(xì)胞的角化相關(guān)［2］。角蛋白的表達(dá)表現(xiàn)出了在組織、部位和時(shí)空上的特異性［12］。既往研究發(fā)現(xiàn)，K1、K10 可在甲母質(zhì)組織中表達(dá)，在甲床中未被檢測(cè)到［13-14］，K10 可做為甲母質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，K1、K10、K5、K14 可在甲母質(zhì)細(xì)胞、正常皮膚及甲下皮中表達(dá)，而在甲床中不表達(dá)，K5、K10同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞只有甲母質(zhì)、皮膚及甲下皮［13，15］。本研究中，我們?cè)诩啄纲|(zhì)取材過(guò)程時(shí)選取了遠(yuǎn)離皮膚及甲下皮的甲母質(zhì)組織進(jìn)行培養(yǎng)，可排除甲下皮及皮膚細(xì)胞污染甲母質(zhì)細(xì)胞，培養(yǎng)后細(xì)胞中K5、K10 陽(yáng)性反應(yīng)幾乎是重疊的，可確定為甲母質(zhì)細(xì)胞。

本研究采用組織塊培養(yǎng)法，將甲母質(zhì)細(xì)胞直接從組織中分離，傳代數(shù)少，可最大限度保持人甲母質(zhì)細(xì)胞特有的生物學(xué)特性。但因組織塊組成復(fù)雜，少量成纖維細(xì)胞即可導(dǎo)致雜質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)。成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中易生長(zhǎng)且生長(zhǎng)速度快，結(jié)果中有部分細(xì)胞不表達(dá)K5、K10，采用K10對(duì)細(xì)胞標(biāo)記，分析人原代甲母質(zhì)細(xì)胞的純度約37.6%。推測(cè)這部分雜質(zhì)細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞。

本研究通過(guò)探索人原代甲母質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)及條件。雖然培養(yǎng)所得的人原代甲母質(zhì)細(xì)胞仍有其他雜質(zhì)細(xì)胞，在后續(xù)研究中可采用流式細(xì)胞儀分選和免疫磁珠分選法純化細(xì)胞。本研究建立的人甲母質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法，可用于進(jìn)一步了解人原代甲母質(zhì)細(xì)胞的生物特性，并從細(xì)胞水平了解甲母質(zhì)細(xì)胞受外界因素干擾下產(chǎn)生的不同反應(yīng)，探索甲母質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)及調(diào)控機(jī)制異常出現(xiàn)的生理生化反應(yīng)，以期為闡明臨床難治性甲病的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突