李秋月，張亞飛，彭潔，王旭，張志強(qiáng)，戴祥生，江東，2

?

柑橘U-box基因家族的鑒定及表達(dá)分析

李秋月1，張亞飛1，彭潔1，王旭1，張志強(qiáng)1，戴祥生3，江東1，2

（1西南大學(xué)柑橘研究所，重慶 400712；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，重慶 400712；3井岡山農(nóng)業(yè)科技園管理委員會，江西井岡山 343000）

【】通過生物信息學(xué)分析U-box在柑橘基因組中的分布、結(jié)構(gòu)及進(jìn)化，研究家族成員在不同組織中的表達(dá)特異性以及對非生物脅迫和激素的響應(yīng)，解析柑橘U-box基因家族的生物學(xué)功能。根據(jù)已經(jīng)報道的擬南芥U-box基因，利用Phytozome數(shù)據(jù)庫中的BLASTp工具鑒定柑橘基因組中的U-box基因。采用MEGA6.0、Cello、SMART、GSDS2.0、ExPASy和MapChart等軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、亞細(xì)胞定位預(yù)測、預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量與等電點(diǎn)等理化性質(zhì)、繪制家族成員Scaffold定位圖等，分析U-box基因家族在低溫脅迫下表達(dá)模式，利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）檢測柑橘U-box基因家族部分成員在NaCl、PEG6000和不同激素處理下的表達(dá)情況。從柑橘克里曼?。ǎ┤蚪M中鑒定出56個基因家族成員，可將其分為7類，即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+WD40-1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM-2和U-box+WD40-2。該家族蛋白理論等電點(diǎn)分布在5.19—9.14，編碼的氨基酸數(shù)目介于281—1 441；亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示該基因家族成員位于細(xì)胞不同位置，主要位于細(xì)胞核或葉綠體，少數(shù)位于質(zhì)膜；聚類分析發(fā)現(xiàn)，柑橘U-box與單子葉植物水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，柑橘中具有相同結(jié)構(gòu)域的成員和擬南芥具有相同結(jié)構(gòu)域的成員聚在一起，表明柑橘U-box成員具有不同生物學(xué)功能；Scaffold定位分析發(fā)現(xiàn)，56個U-box成員分布在1—9Scafflod上且呈不均分布。在冷脅迫下的RNA-Seq分析結(jié)果表明，U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應(yīng)答，并表現(xiàn)出4種不同的應(yīng)答模式；從柑橘U-box基因家族的5個不同簇上分別選取1個代表基因進(jìn)行qRT-PCR，分析結(jié)果表明，在金柑的各個組織中均有表達(dá)，和CcPUB4主要在莖和花中表達(dá)，CcPUB10主要在花、莖和幼果中表達(dá)，主要在葉和莖中表達(dá)，體現(xiàn)了不同U-box成員的組織特異性的表達(dá)差異。CcPUB4和在NaCl脅迫下表達(dá)均上調(diào)，而在鹽脅迫下的表達(dá)無明顯變化。在Na2CO3處理下表達(dá)明顯上調(diào)，與NaCl處理存在一致的表達(dá)趨勢，而CaCl2處理下的表達(dá)與NaCl處理下的表達(dá)趨勢卻存在差異。在PEG6000的處理?xiàng)l件下，的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，CcPUB9、和在PEG6000的處理下無明顯變化。在赤霉素（GA3）處理下，CcPUB4在3 h時明顯上調(diào)，在生長素（IAA）和脫落酸（ABA）下呈現(xiàn)無規(guī)律變化，CcPUB10在ABA處理下表達(dá)量表現(xiàn)出逐漸上升。從柑橘克里曼丁全基因組上鑒定出56個U-box基因成員，各成員均含有U-box保守結(jié)構(gòu)域，并位于細(xì)胞的不同位置。U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應(yīng)答并表現(xiàn)出4種不同的應(yīng)答模式，在NaCl、PEG6000和激素處理下，CcPUB4和有不同程度的響應(yīng)，而CcPUB9和響應(yīng)不明顯或未響應(yīng)。

柑橘；基因家族；激素；脅迫；基因表達(dá)

0 引言

【研究意義】柑橘是世界范圍內(nèi)重要的熱帶、亞熱帶經(jīng)濟(jì)類果樹之一，但由于生物脅迫、非生物脅迫等原因嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。U-box基因參與生物脅迫與非生物脅迫的應(yīng)答，并對不同的激素處理具有不同的應(yīng)答模式。本研究利用生物信息學(xué)的方法對柑橘全基因組的U-box基因家族進(jìn)行全面分析，深入了解柑橘生長發(fā)育和逆境響應(yīng)的分子基礎(chǔ)，研究結(jié)果對于認(rèn)識柑橘U-box的功能和進(jìn)一步培育或改良柑橘抗性品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】泛素26s蛋白酶體途徑（ubiquity-26s proteasomepathway，UPP）是目前己知所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性的蛋白降解途徑[1]，早期的泛素化主要由E1、E2和E3這3種酶來完成。E1激活酶負(fù)責(zé)激活泛素，E2耦聯(lián)酶可直接將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)，或者同泛素一起轉(zhuǎn)移給E3連接酶[2]。決定底物蛋白特異性識別的E3連接酶，根據(jù)作用機(jī)理和亞基的組成可以分為4類：單亞基泛素連接酶，包括HECT（homologous to E6-AP COOH-Terminus）、U-box、RING（really interesting new gene）、多亞基泛素連接酶，如cullin-RING（CRLs）[3]。U-box域在植物、動物和酵母等真核生物中高度保守，由70多個氨基酸殘基構(gòu)成，最早從酵母UFD2（ubiquitin fusion degradation protein-2）中發(fā)現(xiàn)[4]。U-box蛋白參與蛋白泛素化降解，同時也對細(xì)胞進(jìn)行自身功能調(diào)控，并對生物脅迫、非生物脅迫、生長發(fā)育以及對激素做出響應(yīng)[5-8]。GONZALEZ-LAMOTHE等[9]表明在煙草與番茄中參與多個抗病基因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)；同時，U-box泛素連接酶在低溫、干旱、鹽脅迫及光脅迫等非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用，擬南芥中的、、、，辣椒的及大豆中的響應(yīng)植物對低溫、高鹽和干旱的相應(yīng)過程[10-12]；除此之外，一些研究還發(fā)現(xiàn)U-box泛素連接酶調(diào)控植物的生長發(fā)育，BRAUMANN等[13]發(fā)現(xiàn)缺失U-box E3泛素連接酶能夠?qū)е耣rh2和ari-l突變體發(fā)生矮化；U-box蛋白可參與植物激素調(diào)控通路，擬南芥U-box泛素連接酶與脫落酸（ABA）信號通路有關(guān)[14]，在ABA處理下，U-box蛋白在細(xì)胞中重新分配，與野生型相比，突變體種子在萌發(fā)時對ABA耐受性增強(qiáng)。綜上所述，U-box蛋白具有多種生物學(xué)功能，在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及生物脅迫與非生物脅迫方面具有重要作用，因此備受研究者的關(guān)注。【本研究切入點(diǎn)】U-box基因家族廣泛參與植物生物脅迫與非生物脅迫響應(yīng)，但目前對U-box家族的研究主要集中在擬南芥、棉花、番茄、水稻和苜蓿等模式植物中，在柑橘中對U-box基因家族進(jìn)行鑒定和分析尚未見報道。柑橘克里曼?。ǎ┑娜蚪M測序已經(jīng)完成[15]，為進(jìn)一步研究柑橘相關(guān)基因的功能及其相互之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用生物信息學(xué)的方法對柑橘U-box基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對該家族的基本信息、保守結(jié)構(gòu)域、Scafflod定位等進(jìn)行預(yù)測分析，利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行組織表達(dá)模式及對非生物脅迫和激素的響應(yīng)進(jìn)行表達(dá)分析，為闡明柑橘U-box基因家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年5—10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所資源育種室進(jìn)行。

1.1 柑橘U-box基因家族成員鑒定

柑橘克里曼丁橘（）的基因組和蛋白組數(shù)據(jù)下載于公共數(shù)據(jù)庫Phytozome（https:// phytozome.jgi.doe.gov）；在擬南芥數(shù)據(jù)庫（http://www. arabidopsis.org/browse/genefamily/pub.jsp）下載擬南芥U-box基因家族基因序列和蛋白序列。利用3種方法鑒定柑橘中的U-box基因。（1）首先以擬南芥中已經(jīng)鑒定出的64個U-box基因家族成員的蛋白序列在克里曼丁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線BLAST搜索；（2）同時在Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載所有物種U-box結(jié)構(gòu)域序列（PF04564），利用Hmmer2.3.2（http://hmmer.janelia.org/）構(gòu)建隱馬氏模型，在Phytozome的克里曼丁蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索含有U-box結(jié)構(gòu)域的序列；（3）合并（1）和（2）的結(jié)果，去除無完整讀碼框的序列。將得到的結(jié)果使用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)一步分析結(jié)構(gòu)域，去除不包含U-box結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到柑橘U-box家族所有基因。將得到的U-box成員按照Scafflod定位進(jìn)行命名，如：Cc為縮寫，是基因家族的縮寫，1是根據(jù)在Scafflod上的位置給這個成員的序號。對柑橘U-box蛋白的分子量和等電點(diǎn)預(yù)測使用ExPASy Proteomics Server（http://www.expasy.org/proteomics）。同時用在線軟件MBC（http://cello.life.nctu.edu.tw）對柑橘U-box蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

利用MEGA5.2中的MUSCLE程序?qū)㈣b定到的柑橘U-box家族蛋白序列進(jìn)行多重序列比對，并利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。U-box基因家族蛋白的結(jié)構(gòu)域使用在線工具SMART。

1.3 柑橘U-box家族基因結(jié)構(gòu)及Scafflod定位分析

在phytozome數(shù)據(jù)庫中下載已鑒定的柑橘U-box基因的DNA序列，用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu. cn/）制作基因結(jié)構(gòu)圖。同時獲得基因的位置信息，基因的Scafflod定位圖用MapChart軟件展示。

1.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析

從克里曼丁全基因組數(shù)據(jù)庫中提取每個柑橘U-box基因起始密碼子上游2 000 bp基因組序列，順式作用元件預(yù)測使用PlantCARE（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.5 試驗(yàn)材料與處理

選用錦橙（Osbeck.）為試材。2018年10月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所國家果樹種質(zhì)（重慶）柑橘圃采集錦橙果實(shí)，將種子去皮，放在濕潤的培養(yǎng)皿中；然后將其放入28℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽。選取萌發(fā)整齊一致的種子，播種于填裝有混合基質(zhì)的盆中，置人工氣候箱培養(yǎng)（溫度28℃，光照16 h/黑暗8 h），當(dāng)?shù)谝黄嫒~充分展開后，選取長勢一致的幼苗進(jìn)行非生物脅迫和激素處理。激素包括GA3（0.5 mmol·L-1）、ABA（100 μmol·L-1）、IAA（20 μmol·L-1）；非生物脅迫包括高鹽NaCl（300 mmol·L-1）、10%（ω）PEG6000。具體步驟如下：在室溫下，將幼苗洗凈，放入盛有激素或10 μmol·L-1DMSO（激素處理的平行對照）或H2O（非生物脅迫的對照）的滅菌瓶中搖勻，使根系充分接觸液體。分別在處理后的0、3、6、12和24 h收集幼苗，3次生物學(xué)重復(fù)，放入液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為說明在NaCl條件下是受Na+還是Cl-影響，選用對鹽敏感的大果枳（Raf.），用Na2CO3（6.25 g·L-1）和CaCl2（10.1 g·L-1）進(jìn)行處理。處理方式同上。

采集同一時期羅浮金柑（Swing）的莖、嫩葉、花、幼果，液氮速凍，-80℃保存，用于分析U-box家族成員表達(dá)的組織特異性。

1.6 柑橘U-box家族基因的冷脅迫表達(dá)模式分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載枳在冷脅迫、干旱脅迫和鹽脅迫下及4個冷處理下的文庫（GSE67439_pooled- Unigene.fa.gz）并建立本地數(shù)據(jù)庫，用柑橘U-box家族基因的CDS序列在數(shù)據(jù)庫中blast，找到相應(yīng)基因的RNA-Seq編號，然后下載4個冷處理下表達(dá)數(shù)據(jù)，提取出U-box家族基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，利用在線軟件Morpheus（https://software.broadinstitute.org/morpheus/繪制表達(dá)量熱圖。

1.7 總RNA提取與cDNA合成

使用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根）提取植物總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaKa）試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA供熒光定量使用。

1.8 實(shí)時熒光定量 PCR

使用Prime3設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。內(nèi)參為柑橘-，在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀上對柑橘U-box家族的部分成員的表達(dá)量進(jìn)行分析。擴(kuò)增體系含2 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，SYBR 6.25 μL反應(yīng)Mix，3.25 μL ddH2O，總體系12.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，共40個循環(huán)。每個處理3次重復(fù)。用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

表1 本試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果

2.1 柑橘U-box基因家族成員信息

通過在線BLAST比對以及Hmmer搜索，經(jīng)過SMART服務(wù)器分析去除不含U-box結(jié)構(gòu)域的序列，從柑橘基因組中鑒定出56個U-box基因，并且56個柑橘U-box蛋白均含有62—68個氨基酸的U-box結(jié)構(gòu)域，其中40個U-box蛋白的U-box保守結(jié)構(gòu)域都含有63個氨基酸，表2所示。通過ExPASy工具分析，柑橘中最長的U-box蛋白（Ciclev10024300m）包含1 441個氨基酸殘基，分子量也為56個蛋白質(zhì)中最大，為160.62 kD，最短的U-box蛋白（Ciclev10032341m）包含281個氨基酸殘基，分子量是56個蛋白中最小的。等電點(diǎn)范圍為5.19（Ciclev10030837m）—9.14（Ciclev10011217m）。利用Cello軟件對柑橘U-box家族成員進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示該基因家族成員位于細(xì)胞不同位置，其中和定位于質(zhì)膜，、、、、存在于細(xì)胞質(zhì)，其他成員位于細(xì)胞核或葉綠體。

表2 柑橘基因組中的U-box基因

續(xù)表2 Continued table 2

2.2 柑橘U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為研究柑橘U-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對56個柑橘U-box蛋白構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，經(jīng)過SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示除U-box結(jié)構(gòu)域外，柑橘U-box蛋白還含有其他結(jié)構(gòu)域。根據(jù)進(jìn)化樹以及蛋白結(jié)構(gòu)域（圖1），將柑橘中的56個U-box蛋白分為7種類型，即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+ARM-2、Kinase+U-box、U-box+WD40-1、U-box+WD4-2和TPR+U-box類，每一類型分別有17、16、5、8、3、2和5個U-box蛋白。U-box only結(jié)構(gòu)的成員在柑橘中最多，共17個。ARM亞家族在植物中研究較多，并在水稻和擬南芥中都為最大亞類[16]，而在柑橘中為第二大亞類。Kinase亞家族有8個成員，其中3個包含有絲/蘇/酪蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（STYKc domain），另外5個為絲/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（S_TKc domain）。同時本研究發(fā)現(xiàn)其中76%的U-box家族成員的U-box結(jié)構(gòu)域位于N末端，而U-box結(jié)構(gòu)域位于C末端的成員比較少，U-box結(jié)構(gòu)域位于N末端的聚在一起，位于C端的聚為另一類。位于同一亞家族U-box蛋白含有的結(jié)構(gòu)域種類和數(shù)量具有較高的一致性。

為深入研究單子葉植物水稻U-box基因家族與雙子葉植物柑橘和擬南芥U-box基因家族的進(jìn)化關(guān)系，對柑橘（56個）、水稻（77個）和擬南芥（64個）共197個U-box蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖2）。根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近可將197個U-box蛋白分為7個亞家族，分別含有52、59、46、13、2、3和20個U-box基因。雙子葉和單子葉植物的U-box家族成員在7個亞家族內(nèi)均有分布。第Ⅰ亞家族和第Ⅱ亞家族含有的結(jié)構(gòu)域較單一，而其他亞家族含有多種不同的結(jié)構(gòu)域。和單獨(dú)聚在一個小分支上，在擬南芥中未發(fā)現(xiàn)與其高度同源的序列。和進(jìn)化距離最近，推測其在功能上具有一定的相似性。

Ⅰ：U-box only；Ⅱ：U-box+ARM；Ⅲ：U-box+WD40_1；Ⅳ：TPR+U-box；Ⅴ：Kinase+U-box；Ⅵ：U-box+ARM_2；Ⅶ：U-box+WD40_2

圖2 柑橘、擬南芥和水稻U-box家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 柑橘U-box家族基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

利用GSDS軟件對U-box家族各成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示（圖3），柑橘U-box家族的基因結(jié)構(gòu)存在較大的差異，外顯子數(shù)目為1—16個，內(nèi)含子數(shù)目為0—15個。對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，U-box only亞家族的基因結(jié)構(gòu)較簡單，一半成員都不含內(nèi)含子；含有U-box和ARM結(jié)構(gòu)域的成員中多數(shù)基因含有3個內(nèi)含子；含有U-box和Kinase結(jié)構(gòu)域的成員的基因結(jié)構(gòu)極為相似，內(nèi)含子數(shù)目在6—9個；具有U-box和WD40結(jié)構(gòu)域的成員所含內(nèi)含子數(shù)目最多，內(nèi)含子數(shù)在12—15個；含有TPR和U-box結(jié)構(gòu)域的成員含有7個內(nèi)含子。

根據(jù)U-box家族在Scafflod的位置信息，利用MapChart軟件獲得了56個U-box基因在柑橘Scafflod上的分布圖（圖4）。由圖可知，柑橘U-box家族成員在Scafflod上呈不均分布。在3號、6號和8號Scafflod上分布最多，含有8個U-box基因，而1號Scafflod上分布的U-box基因最少，只含有2個U-box成員。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，U-box在Scafflod上呈現(xiàn)區(qū)域性，從4號、5號、6號、7號和8號Scafflod中可以看到，在Scafflod上的某個區(qū)域家族成員比較集中。

圖3 56個柑橘U-box基因的結(jié)構(gòu)分析

圖4 柑橘U-box基因在Scafflod上的定位（Mb）

2.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析

分析基因啟動子的作用元件可以預(yù)測基因的潛在功能，為了解柑橘U-box家族應(yīng)答生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)的潛在機(jī)制，本研究分析了柑橘U-box家族的啟動子的順式作用元件。結(jié)果表明，該家族的啟動子區(qū)域富含響應(yīng)植物激素和逆境脅迫的順式作用元件（表3）。幾乎所有柑橘U-box基因啟動子區(qū)至少含有一個植物激素響應(yīng)元件，包括赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，乙烯響應(yīng)元件ERE，MeJA響應(yīng)元件TGACG-motif和脫落酸（ABA）響應(yīng)元件ABRE等，51個U-box基因（占總基因數(shù)91.1%）至少含有一種生物或非生物脅迫響應(yīng)元件，非生物響應(yīng)元件包括光響應(yīng)元件G-box、低溫脅迫響應(yīng)元件LTR、冷和脫水響應(yīng)元件DRE等。

表3 PlantCARE預(yù)測CcPUB基因家族啟動子區(qū)順式作用原件

2.5 U-box家族基因的表達(dá)分析

2.5.1 組織特異性 為了解柑橘U-box基因家族5種結(jié)構(gòu)域（U-box only、U-box+ARM、U-box+WD40、Kinase+U-box、TPR+U-box）的組織表達(dá)模式，分別從5種結(jié)構(gòu)域中-選取1個代表基因進(jìn)行組織特異性分析，利用qRT-PCR分析其在金柑嫩葉、幼果、莖和花中的相對表達(dá)量。由圖（5）可看出，這5個基因在各個組織中均有表達(dá)。其中和8在幼果中表達(dá)量都較低，而CcPUB10主要在幼果中表達(dá)，CcPUB4主要在花中表達(dá)，CcPUB41和CcPUB48主要在莖中表達(dá)。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.5.2 激素對表達(dá)的影響 利用qRT-PCR分析柑橘U-box基因家族中5個代表基因在ABA、GA3和IAA處理下的相對表達(dá)量（圖6）。除了CcPUB9、和不響應(yīng)ABA、GA3和IAA外，CcPUB4和對各處理表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。在ABA和IAA處理下，CcPUB4的表達(dá)量在0—12 h無明顯變化，在處理24 h后CcPUB4的表達(dá)明顯受到抑制，而在GA3處理3 h后表現(xiàn)為上調(diào)，的表達(dá)量是對照的4倍。在ABA的處理下表達(dá)呈現(xiàn)上升的趨勢，而在GA3處理24 h后表達(dá)下調(diào)，在IAA的處理下無明顯變化。上述結(jié)果表明，激素能夠誘導(dǎo)CcPUB4基因的表達(dá)。

2.5.3 非生物脅迫對表達(dá)的影響 在鹽脅迫條件下，CcPUB4CcPUB9和表達(dá)均上調(diào)，且CcPUB4、呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢，而的表達(dá)不受NaCl的誘導(dǎo)（圖7）。在PEG6000的處理?xiàng)l件下，的表達(dá)量呈現(xiàn)先上調(diào)后下降，而CcPUB9、和在PEG6000的處理下無明顯變化，在PEG6000條件下無規(guī)律變化。

2.5.4 Na2CO3和CaCl2條件下，的相對表達(dá)量 由于植物在鹽脅迫的條件下會改變細(xì)胞中已有的Na+和Cl-平衡，通過上述的非生物脅迫的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在NaCl條件下顯著表達(dá)，但是并不能確定該基因是受NaCl中哪種離子的影響，因此，采用相同濃度的Na+和Cl-對枳殼進(jìn)行處理。結(jié)果顯示在Na2CO3條件下顯著上調(diào)，并且與在NaCl條件下的表達(dá)趨勢相似，在CaCl2條件下的表達(dá)趨勢卻與在NaCl條件下的表達(dá)趨勢不同（圖8）。

圖6 不同外源激素處理?xiàng)l件下CcPUB4、CcPUB9、CcPUB10、CcPUB41和CcPUB48的相對表達(dá)量

圖7 非生物脅迫下CcPUB4、CcPUB9 、CcPUB10、CcPUB41和CcPUB48的相對表達(dá)量

圖8 在Na2CO3和CaCl2脅迫下CcPUB4的相對表達(dá)量

2.5.5在冷脅迫下的表達(dá)模式分析 柑橘U-box蛋白可參與調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的應(yīng)答，因此，利用枳的RNA-Seq數(shù)據(jù)分析該基因家族在冷脅迫下的表達(dá)模式。在干旱脅迫、鹽脅迫和冷脅迫的RNA-Seq文庫中，找到47個U-box基因序列，其中35個基因在0、6、24和72 h冷脅迫下有表達(dá)數(shù)據(jù)，其他12個在冷脅迫下沒有表達(dá)數(shù)據(jù)（、、、、、、、、、、、）。利用Morpheus繪制35個U-box基因的表達(dá)熱圖，分析顯示，這35個基因在冷脅迫下具有表達(dá)差異，并且在冷脅迫下具有4種不同的應(yīng)答模式（圖9），、、、、聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達(dá)量是先下降再上升；、、、、、和聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達(dá)量降低；、、、、、、和聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達(dá)量先上升再下降；、、、、、、、、、、和聚在一分支，該分支的基因都響應(yīng)冷脅迫，所有基因的表達(dá)量都上升。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，一些進(jìn)化關(guān)系比較接近的U-box基因，在冷脅迫下具有相同的表達(dá)模式并聚在一起，如CcPUB40和CcPUB53，CcPUB36和CcPUB37，CcPUB19、CcPUB20和CcPUB21。

圖9 柑橘U-box家族在冷脅迫下的表達(dá)譜分析

3 討論

U-box基因家族是一類具有U-box結(jié)構(gòu)域的基因家族，其所編碼蛋白大部分是泛素系統(tǒng)中決定底物識別特性的泛素連接酶E3。從酵母到人類，幾乎所有真核生物都含有U-box蛋白，尤其是植物體內(nèi)大量存在該類蛋白，如苜蓿中有41個U-box基因[16]，擬南芥基因組中存在64個U-box基因[17]，水稻（）中已鑒定出77個帶有U-box結(jié)構(gòu)的基因[18]，番茄中鑒定出56個U-box基因[19]，雷蒙德氏棉中有93個基因家族成員[20]，人有21個U-box基因[21]。本研究從克里曼丁全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了56個U-box基因成員，與番茄中U-box成員數(shù)相同，而少于擬南芥和水稻中的成員數(shù)，表明不同物種的U-box成員數(shù)存在差異。雖然番茄的U-box數(shù)量與柑橘中的數(shù)量一樣多，但其基因組大小約為900 Mb[22]，遠(yuǎn)大于柑橘301.4 Mb[15]，由此可見U-box基因家族成員的多少與基因組大小沒有直接關(guān)系，這與鄭興衛(wèi)等[16]在苜蓿U-box基因家族研究中的結(jié)論一致。柑橘U-box基因家族的蛋白質(zhì)大小在31.97—160.62 kD之間，PI在5.19—9.14之間，表明柑橘U-box基因家族成員間的蛋白質(zhì)大小、PI等特征差異較大。除了含有U-box結(jié)構(gòu)域外，U-box蛋白中還存在ARM、WD40和TPR二級結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域主要用來介導(dǎo)U-box蛋白與底物蛋白的特異性識別。

為了對柑橘中的U-box家族進(jìn)行功能歸類，利用聚類分析法構(gòu)建柑橘、水稻和擬南芥的U-box家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，由于U-box基因的保守性，具有相似或者相同功能的基因位于同一組，這為研究該基因家族相關(guān)基因的功能提供了可靠的依據(jù)。在擬南芥中一些成員的功能已經(jīng)得到驗(yàn)證：TPR+U-box亞家族中的參與非生物脅迫調(diào)節(jié)，在低溫和黑暗條件下，改變應(yīng)激反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中PP2A的活性，從而對非生物脅迫做出響應(yīng)[23]，柑橘與擬南芥聚在一起，具有較近的親緣關(guān)系，猜測TPR+U-box亞家族其他成員在柑橘中起著同樣的作用。U-box+ARM是研究最多的亞家族，屬于U-box+ARM亞家族的、、和在干旱脅迫中起著重要作用[24-25]，能正調(diào)控細(xì)胞凋亡和植物防御的過程[26]，同時在磷酸鹽饑餓條件下調(diào)控側(cè)根的發(fā)育[27]，由此推測U-box+ARM亞家族其他基因具有相同或相似的功能。U-box only亞家族的基因結(jié)構(gòu)簡單，在植物生長發(fā)育和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，齊晨輝等[28]發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)的蘋果愈傷組織和異位表達(dá)的擬南芥幼苗在鹽脅迫條件下，生長勢與野生型相比明顯變?nèi)酰砻髫?fù)調(diào)控鹽脅迫。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系中基因的同源性，可以推測位于同一組的擬南芥在柑橘中的直系同源基因也可能參與相似的調(diào)控途徑。

本研究對單子葉和雙子葉植物中的U-box基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，單子葉植物和雙子葉植物在7個亞家族中均有分布，說明U-box家族在進(jìn)化上較保守，U-box家族的起源出現(xiàn)在單雙子葉植物分化之前。本研究發(fā)現(xiàn)第Ⅰ亞家族和第Ⅱ亞家族的U-box成員數(shù)較多，推測該亞家族中的U-box基因可能在植物的生命進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。在第Ⅴ亞家族中沒有擬南芥的成員，可能是該亞家族的基因發(fā)生了丟失現(xiàn)象。和位于同一聚類組中并且位于相同的染色體上，和也出現(xiàn)這種緊密連鎖，推測在進(jìn)化的過程中這些基因可能通過染色體內(nèi)的復(fù)制發(fā)生了特異性擴(kuò)張，這些基因的功能有待進(jìn)一步研究。

U-box基因參與了葉、花、莖和果的生長發(fā)育[29-30]，本試驗(yàn)中的CcPUB10主要在果和花中表達(dá)，在葉中幾乎不表達(dá)；CcPUB4主要在花和莖中表達(dá)，而CcPUB41和CcPUB48在莖中顯著表達(dá)，表明柑橘U-box基因調(diào)控葉、花、莖和果生長發(fā)育。近年來，大量研究表明，E3泛素連接酶是一種極其活躍的激素感知成分，在激素途徑的抑制解除以及激素生物合成的調(diào)控中具有重要作用[31]。本試驗(yàn)通過外施IAA、GA3和ABA激素處理，實(shí)時熒光定量結(jié)果顯示，在GA3的處理下，上調(diào)，在ABA和IAA處理24 h表達(dá)受到抑制；在ABA的處理下呈現(xiàn)逐漸上調(diào)，在GA3和IAA的處理下無明顯規(guī)律。U-box only亞家族的、TPR+U-box亞家族的、U-box+WD40-1亞家族的以及Kinase+U-box亞家族的均受NaCl的影響呈現(xiàn)上調(diào)，且在NaCl處理12 h后其表達(dá)量是對照的270倍，說明該基因可能參與了植物的鹽脅迫響應(yīng)，Hwang等[32]抑制擬南芥導(dǎo)致發(fā)芽期間對鹽脅迫的耐受性增加，同時，Cho等[33]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超表達(dá)辣椒的植株耐鹽性增加。在鹽脅迫的條件下可破壞細(xì)胞中已有的Na+和Cl-平衡，因此本試驗(yàn)用Na2CO3和CaCl2對枳殼進(jìn)行處理，進(jìn)一步探明是外源的Na+還是Cl-會引起CcPUB4表達(dá)量上升，結(jié)果顯示在Na2CO3處理下CcPUB4表達(dá)明顯上調(diào)且和NaCl呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式，而CaCl2處理只在處理后3 h有較高的表達(dá)水平，之后CcPUB4的表達(dá)水平降低到正常值，證實(shí)了鹽脅迫下，細(xì)胞中的Na+平衡被打破。如何在鹽脅迫下發(fā)揮作用，是下一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容。CcPUB4在PEG6000下的條件下表達(dá)量先上升再下降，其結(jié)果與擬南芥的同源基因AtPUB20在干旱脅迫下的結(jié)果一致[34]，Seo等[35]研究證實(shí)U-box家族中的/和/在干旱脅迫下分別是ABA依賴和ABA非依賴途徑的負(fù)調(diào)控因子。不同成員間在冷脅迫下具有不同的應(yīng)答模式。通過對這35個基因的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，其中17個基因包含冷脅迫響應(yīng)元件DRE或低溫響應(yīng)元件LTR，表明對冷脅迫具有響應(yīng)。其中，在冷脅迫下是上調(diào)表達(dá)的并且都屬于U-box only亞族，由此預(yù)測U-box only亞族在冷脅迫過程中存在著正調(diào)控作用，與同源的在冷脅迫下上調(diào)[11]，Yee等[36]對擬南芥的U-box家族在冷脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)U-box基因?qū)涿{迫都具有響應(yīng)，該結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在冷脅迫下只有35個U-box基因有表達(dá)數(shù)據(jù)，其他12個沒有在冷脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)，可能是由于該測序的混合池中包括鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)數(shù)據(jù)[37]，這12個基因只在鹽脅迫和干旱脅迫下特定響應(yīng)。綜上可知，U-box基因家族可能參與了植物激素以及逆境響應(yīng)調(diào)控。對CcPUBs基因家族的啟動子分析發(fā)現(xiàn)，其啟動子均含有逆境、激素、溫度等響應(yīng)順式作用元件如G-box光響應(yīng)元件、DRE冷和脫水響應(yīng)元件、MBS、MYB結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件等，該結(jié)果為柑橘U-box基因?qū)δ婢澈图に氐膽?yīng)答機(jī)制提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從柑橘全基因組上鑒定出56個U-box基因成員，其蛋白均含有U-box保守結(jié)構(gòu)域。除U-box only亞家族和U-box+ARM-1亞家族部分成員不含內(nèi)含子外，其余成員均含有內(nèi)含子，內(nèi)含子數(shù)在0—15個。亞細(xì)胞定位顯示柑橘U-box家族基因成員在細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜中均存在。56個U-box基因分布在1—9號Scaffold且分布不均，U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應(yīng)答，并表現(xiàn)出4種不同的應(yīng)答模式。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，柑橘U-box基因家族表達(dá)具有組織特異性，且對激素和非生物脅迫有不同程度的響應(yīng)。

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Genome Wide Identification and Expression Analysis of the U-box Gene Family in Citrus

LI QiuYue1, ZHANG YaFei1, PENG Jie, WANG Xu1, ZHANG ZhiQiang1, DAI XiangSheng3, JIANG Dong1,2

(1Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712;3Management Committee of Jinggangshan Agricultural Science and Technology Park, Jinggangshan 343000, Jiangxi)

【】The objectives of this study were to analyze the distribution, structure and evolution of U-box in citrus genome by bioinformatics, to study the expression specificity of family members in different tissues and their responses to abiotic stress and hormones, and to investigate the biological function of U-box gene family in citrus. 【】According to the reported U-box gene of Arabidopsis thaliana, the U-box gene in citrus genome was identified by BLASTp tool in Phytozome database. Phylogenetic tree, subcellular localization prediction, relative mass and isoelectric point and other physical and chemical properties, and scaffoldlocation of U-box member were analyzed with MEGA6.0, Cello, SMART, GSDS2.0, ExPASy and MapChart, respectively. The expression pattern of U-box gene family under low temperature stress was analyzed, and the expression of some members of U-box gene family in citrus treated with NaCl, PEG6000 and different hormones was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR)【】Fifty-six members ofgene family were identified from the whole genome of, and they could be divided into 7 categories, namely as U-box only, U-box+ARM-1, U-box+WD40-1, TPR+U-box, Kinase+U-box, U-box+ARM-2 and U-box+WD40-2. The theoretical isoelectric point of the family protein was ranged from 5.19 to 9.14, and the number of amino acids encoded was 281 to 1 441. The results of subcellular localization prediction showed that the members of the gene family were located in different positions of the cell, mainly in the nucleus or chloroplast, and a few in the plasma membrane. Cluster analysis showed that citrus U-box was closely related to monocotyledonous rice, and members with the same domain in citrus andwere clustered together. The results showed that U-box members of citrus had different biological functions, and scaffold localization analysis showed that 56 U-box members were unevenly distributed on citrus 1-9 scaffold. The results of RNA-Seq analysis under cold stress showed that U-box gene family was involved in the response of plants to cold stress and showed four different response patterns. One representative gene was selected respectively from five different clusters of citrus U-box gene family for qRT-PCR analysis. The results showed thatwas expressed in all tissues of kumquat, andandwere mainly expressed in stems and flowers,was mainly expressed in flowers, stems and young fruits, andwas mainly expressed in leaves and stems. It reflected the tissue-specific expression difference of different U-box members. The expression of,andwas up-regulated under NaCl stress, but the expression ofhad no significant change under salt stress. The expression ofwas up-regulated under Na-2CO3treatment, which was consistent with that of NaCl treatment, but the expression trend of CaCl2treatment was different from that of NaCl treatment. Under the treatment of PEG6000, the expression ofincreased at first and then decreased, while,anddid not change significantly under the treatment of PEG6000. Under gibberellin (GA3) treatment,was significantly up-regulated at 3 h, while under auxin (IAA) and abscisic acid (ABA), the expression ofshowed irregular changes, and the expression ofincreased gradually under gibberellin (gibberellin) treatment.【】Fifty-six members of U-box gene were identified from the whole genome of. All members contained U-box conserved domain and were located in different positions of cells. U-box gene family was involved in the response of plants to cold stress and showed four different response patterns. Under NaCl, PEG6000 and hormone treatment,andhad different degrees of response, but,andhad no obvious or no response. This experiment provided a theoretical guidance for the further study of U-box gene family in citrus stress resistance and growth and development mechanism.

citrus;gene family; hormone; stress; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.009

2018-12-29；

2019-02-18

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000101）、重慶市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2016shms-ztzx80004）

李秋月，E-mail：437010037@qq.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）