張鵬云，李 蓉，盧俊文，張朋杰，陳麗斯，張 峰

(1.中山出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528400；2.廣東藥科大學 公共衛(wèi)生學院，廣東 中山 528458；3.中國檢驗檢疫科學研究院 食品安全研究所，北京 100176)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)又名酸刺，是胡頹子科沙棘屬植物的干燥成熟果實，是一種藥食同源植物[1]，在抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、保護心腦血管系統(tǒng)、增強免疫力等方面具有明顯的藥理作用，并廣泛應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥保健品、食品等領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟價值[2-5]。此外，沙棘適應(yīng)能力強，耐旱、耐寒、耐鹽堿、抗風沙，對生態(tài)環(huán)境的改善也具有積極作用，主要在我國的西北、西南、東北等地區(qū)種植[6]。近些年人們對沙棘的研究主要集中在黃酮類、氨基酸、脂肪酸等化學成分[7]，而對于其揮發(fā)油的報道相對較少，如杜然等[8]利用超臨界CO2萃取法從西藏產(chǎn)沙棘中提取揮發(fā)油，并鑒定出14種化合物，主要成分為不飽和脂肪酸；盧金清等[9]采用水蒸氣蒸餾法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)提取并鑒定沙棘揮發(fā)油成分，最終鑒定出46個組分，主要成分為脂肪酸類化合物；胡蘭等[10]利用水蒸氣蒸餾法提取新疆兩個產(chǎn)地的沙棘揮發(fā)油，分別鑒定出44種和50種組分，主要成分為烷烴類和醇類化合物，兩者有17種共同組分。由此看出不同產(chǎn)地沙棘揮發(fā)油所含化合物種類及含量差異較大。

頂空-固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)是近些年發(fā)展起來的前處理方法，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，具有操作簡便、樣品使用量少、無需溶劑、易實現(xiàn)自動化、分析速度快[11]等優(yōu)勢。而傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法(SD)使用的裝置簡單、易操作、避免了有機溶劑萃取造成的污染，但該方法溫度高、耗時長、易出現(xiàn)焦糊現(xiàn)象，且揮發(fā)油得率低[12]。因此本研究利用HS-SPME法萃取沙棘揮發(fā)性成分，并比較了HS-SPME法和SD法對沙棘揮發(fā)油化學成分的影響，以期得出2種提取方法的共同點和差異性，為沙棘的鑒別與品質(zhì)評價提供技術(shù)保障，為其進一步研究開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

沙棘干藥材(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古，批號：180201)，水分為7.8%，總灰分為3.8%，購自湖南省南國藥都中藥飲片有限公司。氯化鈉、無水硫酸鈉、正己烷均為分析純，購自廣州化學試劑廠；正構(gòu)烷烴混合標準品(C7～C40，美國o2si公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ 8000氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)：配電子電離源及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、TRIPLUS RSH自動進樣器、固相微萃取自動進樣手柄、20 mL頂空樣品瓶(配有聚四氟乙烯墊的螺紋密封蓋)；DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭(50/30 μm，美國Supelco公司)。

1.3 樣品前處理

1.3.1 頂空固相微萃取法準確稱取2.0 g沙棘置于20 mL頂空瓶中，用自動進樣器將頂空瓶置于70 ℃孵化爐中平衡20 min，再將老化過的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入樣品瓶頂空部分熱吸附50 min，之后將吸附后的萃取頭插入氣相色譜進樣口，于250 ℃條件下解吸7 min，最后進GC-MS系統(tǒng)分離檢測。

1.3.2 水蒸氣蒸餾法準確稱取200.0 g沙棘放入2 000 mL圓底燒瓶中，加入1 500 mL飽和氯化鈉溶液，浸泡過夜，參照2015版《中國藥典》一部揮發(fā)油測定法甲法提取5 h，靜置30 min，加入2 mL正己烷萃取，在萃取液中添加適量無水硫酸鈉除水干燥，過0.45 μm有機濾膜后作為樣品儲備液，稀釋10倍后進GC-MS系統(tǒng)分離檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 頂空固相微萃取法色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至225 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃并保持3 min；分流比10∶1，流速1.2 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；載氣： 高純度(99.999%)氦氣。

質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電子轟擊能量：70 eV；掃描方式：全掃描(Scan)；質(zhì)量掃描范圍m/z40～450，溶劑延遲4.0 min。

1.4.2 水蒸氣蒸餾法色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至190 ℃，再以3 ℃/min升至225 ℃，最后以10 ℃/min升至250 ℃并保持10 min；分流進樣，分流比10∶1，流速1.2 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；載氣：高純度(99.999%)氦氣；進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件與“1.4.1”相同。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1 保留指數(shù)的計算C7～C40正構(gòu)烷烴混標與沙棘樣品在相同的氣相條件下得到總離子流圖后，工作站根據(jù)公式自動得出各揮發(fā)性組分的保留指數(shù)。保留指數(shù)的計算公式如下：

RI=100n+100(RTx-RTn)/(RTn+1-RTn)

式中：RI為待測化合物的保留指數(shù)；n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；RTx為待測化合物的保留時間(min)；RTn和RTn+1分別為碳原子數(shù)為n、n+1正構(gòu)烷烴的保留時間(min)，且RTn+1>RTx>RTn。

1.5.2 定性分析將得到的總離子流圖通過自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS)進行處理，所分辨的質(zhì)譜在NIST2.2標準譜庫中檢索，根據(jù)匹配度和保留指數(shù)進行核對，只記錄正匹配和反匹配均大于800的化合物，并用峰面積歸一化法計算沙棘各揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量。

1.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與圖像處理本研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和圖像處理均在Microsoft Excel表格中完成。扣除總離子流圖中的雜質(zhì)和柱流失的峰后，對目標峰進行積分，再利用軟件將具體信息導入Excel表格中，即得到各條件下的沙棘揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積和峰數(shù)目。

2 結(jié)果與討論

2.1 頂空-固相微萃取條件的優(yōu)化

據(jù)文獻報道，頂空-固相微萃取法中的萃取溫度、萃取時間、解吸時間、平衡時間等條件對揮發(fā)性成分的萃取效果影響顯著[13]。本研究以峰面積代表萃取物質(zhì)的量，出峰數(shù)代表萃取物質(zhì)的種類，通過總峰面積和總峰數(shù)來評價萃取效果，確定HS-SPME萃取沙棘揮發(fā)油成分的較優(yōu)條件。

2.1.1 萃取溫度的選擇準確稱取沙棘2.0 g于20 mL頂空瓶中，在萃取時間為30 min，解吸時間為3 min，平衡時間為10 min的條件下，考察不同萃取溫度(40、50、60、70、80 ℃)的萃取效果，每個水平重復3次。結(jié)果顯示，隨著萃取溫度的升高，沙棘揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積不斷增大，且當溫度超過70 ℃時，總峰面積急劇上升；而出峰數(shù)目隨萃取溫度的升高呈先增加后降低的趨勢，并在70 ℃時達到最大。研究發(fā)現(xiàn)當萃取溫度達到80 ℃時，保留時間靠后的幾個組分的峰響應(yīng)突然變大，峰面積約為70 ℃時的4倍，而先出峰的一些組分響應(yīng)卻降低，且峰形變差，因此造成80 ℃下?lián)]發(fā)性成分的總峰面積較大，峰數(shù)目卻減少的結(jié)果。這可能是因為在低溫條件下，揮發(fā)性物質(zhì)在基質(zhì)間擴散緩慢，需較長時間才能達到動態(tài)平衡，當溫度升高后揮發(fā)性組分的運動速率加快，更加有利于萃取頭對目標物的富集吸附[14-15]。但溫度過高會使低沸點組分在競爭吸附中處于劣勢地位，造成部分化合物流失[16]?？紤]到萃取效果的全面性，本研究選定70 ℃為較優(yōu)萃取溫度。

2.1.2 萃取時間的選擇實驗考察了不同萃取時間(30、40、50、60 min)對沙棘揮發(fā)性成分萃取效果的影響。結(jié)果顯示，當萃取時間為30～50 min時，總峰面積和峰數(shù)目均隨著萃取時間的增加而逐漸增大，而當萃取時間為60 min時，雖然總峰面積略有增加，但出峰數(shù)卻明顯降低，這是因為隨著萃取時間的延長，分析物逐漸在萃取頭、頂空和樣品3相中達到平衡，然后被萃取頭吸附[17]。當萃取時間不足時，目標物被吸附不充分；若萃取時間較長，已經(jīng)被萃取頭吸附的揮發(fā)性組分可能逸出，出現(xiàn)解吸附現(xiàn)象[18]。綜合考慮，本研究選擇萃取時間為50 min。

2.1.3 解吸時間的選擇在確定萃取溫度、萃取時間的基礎(chǔ)上，考察了不同解吸時間(3、5、7、9、11 min)的萃取效果。結(jié)果顯示，當解吸時間由3 min增加到5 min時，總峰面積和總峰數(shù)均略有增加；而解吸時間大于5 min后，總峰面積和總峰數(shù)均無顯著變化。這是由于解吸時間較短時，待測物解吸不完全，不但影響檢測結(jié)果，還會污染后續(xù)樣品[19]；解吸時間過長時，雖然揮發(fā)性組分能夠充分解吸，但會導致峰形變寬，部分組分發(fā)生氧化，縮短萃取頭的使用壽命[14-15,20]。綜合考慮，本研究選擇解吸時間為7 min。

2.1.4 平衡時間的選擇實驗考察了不同平衡時間(10、15、20、25、30 min)的萃取效果。結(jié)果顯示，隨著平衡時間的增加，總峰面積和出峰數(shù)的總體變化不明顯。當平衡時間超過10 min時，總峰面積稍有增加，在20 min時達到最大值。表明20 min時揮發(fā)性物質(zhì)在氣相中已達到平衡狀態(tài)，因此本研究選擇平衡時間為20 min。

圖1 HS-SPME(A)和SD法(B)提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of HS-SPME(A) and SD(B) extracts

2.2 HS-SPME/GC-MS法檢測結(jié)果與分析

在優(yōu)化后的HS-SPME萃取條件下對沙棘揮發(fā)性成分進行提取并通過GC-MS檢測，得總離子流圖(圖1A)，再利用AMDIS和保留指數(shù)進行定性分析。最終檢出106個峰，鑒定出76種組分，占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的90.19%，包含20種酯類(31.84%)、17種醛類(31.51%)、9種酮類(10.30%)、13種烯烴類(6.44%)、7種醇類(5.86%)以及10種其他種類化合物(4.25%)。其中，含量最高的組分為甲基十六碳-9-烯酸酯(9.42%)，其次為壬醛(9.40%)、糠醛(7.24%)、棕櫚酸甲酯(5.96%)。

2.3 SD/GC-MS法檢測結(jié)果與分析

對SD法提取的沙棘揮發(fā)油成分采用GC-MS檢測得到沙棘揮發(fā)油總離子流圖(圖1B)。結(jié)果顯示，提取物中共檢出93個峰，鑒定出56種組分，占揮發(fā)性物質(zhì)總峰面積的91.98%(表1)，主要為21種酯類化合物(83.74%)、7種烯烴類化合物(4.25%)、5種酮類化合物(0.59%)、5種醛類化合物(0.98%)、2種有機酸類化合物(0.72%)、3種醇類化合物(0.56%)和13種其他種類化合物(1.13%)。其中有4種組分的相對百分含量超過10%，分別是甲基十六碳-9-烯酸酯(18.61%)、棕櫚酸甲酯(16.21%)、亞油酸甲酯(13.41%)、(Z)-9-十八烯酸甲酯(12.78%)，這4種酯類化合物占揮發(fā)性組分總量的61.01%，構(gòu)成了沙棘揮發(fā)油的主要成分。

表1 HS-SPME法和SD法提取得到的沙棘揮發(fā)性成分Table 1 Extraction of the volatile components from Hippophae rhamnoides L.by HS-SPME and SD method

(續(xù)表1)

No.FormulaComponentRetentionindexRelativecontent(%)RIexpRIlit[22]HS-SPMESD30C10H18OMenthone(胡薄荷酮)115811540.19-31C9H16O(E)-2-Nonenal(反式-2-壬烯醛)116411620.61-32C9H20O1-Nonanol(1-壬醇)117611730.14-33C10H18OL-4-terpineol(L-4-萜品醇)118411820.49-34C10H8Naphthalene(萘)119111820.63-35C10H18Oα-Terpineol(α-松油醇)11951189-0.0336C10H14OSafranal(藏花醛)120512010.470.0137C10H20ODecanal(癸醛)120812060.48-38C10H20O2Nonanoicacid,methylester(壬酸甲酯)122712251.37-39C12H18O2trans-Chrysanthenylacetate(反式-乙酸菊烯酯)123912390.36-40C10H16OPulegone(長葉薄荷酮)124612370.40-41C10H12O2Phenethylacetate(乙酸苯乙酯)126312580.37-42C9H18O2Nonanoicacid(壬酸)12671273-0.0243C12H20O2Bornylacetate(乙酸龍腦酯)129012850.95-44C11H14O2Isobutylbenzoate(苯甲酸異丁酯)131013210.45-45C13H161,1,6-Trimethyl-1,2-dihydronaphthalene(1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘)136113540.140.0246C14H303-Methyltridecane(3-甲基十三烷)136913710.20-47C13H18Oβ-Damascenone(大馬士酮)13781386-0.0248C15H24Copaene(可巴烯)138213760.43-49C15H24β-Bourbonene(β-波旁烯)139213840.70-50C12H24ODodecanal(月桂醛)141214090.11-51C15H24α-Cedrene(α-雪松烯)142114110.69-52C15H24Caryophyllene(石竹烯)142714191.13-53C13H20Oα-Ionone(α-紫羅酮)143514261.210.1054C12H16O2Isopentylbenzoate(苯甲酸異戊酯)14371439-0.0455C15H24Calarene(白菖烯)144014320.42-56C12H16O2Isopentylbenzoate(苯甲酸異戊酯)144514390.52-57C13H22Otrans-Geranylacetone(反式-香葉基丙酮)145814530.84-58C13H20Oβ-Ionone(β-紫羅酮)14781486-0.0959C15H24γ-Muurolene(γ-衣蘭油烯)148414770.52-60C15H22α-Curcumene(α-姜黃烯)148714830.340.0361C10H16O25,6-Dihydro-6-pentyl-2H-pyran-2-one(5,6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮)149015014.25-62C15H24Valencene(朱欒倍半萜)150114920.15-63C15H24α-Muurolene(α-衣蘭油烯)150814990.38-64C15H281-Pentadecyne(1-十五炔)15101518-0.1565C13H26OTridecanal(十三醛)151415120.83-66C15H24β-Cadinene(β-蓽澄茄烯)15191518-0.0467C15H24γ-Cadinene(γ-蓽澄茄烯)152215130.29-68C13H26O2Dodecanoicacid,methylester(十二酸甲酯)152715260.24-69C15H24δ-Cadinene(δ-蓽澄茄烯)153215240.83-70C15H24Dauca-4(11),8-diene153915320.26-71C15H20α-Calacorene(α-二去氫菖蒲烯)15411542-0.0372C11H16O2Dihydroactinidiolide(奇異果內(nèi)酯)154715321.44-73C15H24OCaryophylleneoxide(石竹烯氧化物)159615810.74-74C14H28OTetradecanal(十四烷醛)161616131.43-75C15H26Oα-Cadinol(α-畢橙茄醇)16561653-0.1076C16H182,2′,5,5′-Tetramethyl-1,1′-biphenyl(2,2′,5,5′-四甲基聯(lián)苯)16721663-0.4477C16H161,3-Diphenyl-1-butene(1,3-二苯基-1-丁烯)1679--0.1378C15H30O1-Pentadecanal(十五醛)171817150.300.6779C15H30O2Methyltetradecanoate(肉豆蔻酸甲酯)172817250.830.7580C16H26O2,6-Ditert-butyl-4-ethylphenol(2,6-二叔丁基-4-乙基苯酚)17601754-0.0881C14H10Phenanthrene(菲)17781775-0.0882C16H32O2Tetradecanoicacid,ethylester(十四酸乙酯)17921794-0.1183C20H422,6,10,14-Tetramethylhexdecane(2,6,10,14-四甲十六烷)18061792-0.0784C16H32OHexadecanal(十六醛)182018170.59-85C16H32O2Pentadecanoicacid,methylester(十五碳酸甲酯)18231820-0.0986C18H36OHexahydrofarnesylacetone(植酮)184718440.280.3787C16H22O4Diisobutylphthalate(鄰苯二甲酸二異丁酯)187718700.39-88C17H32O2Methylhexadec-9-enoate(甲基十六碳-9-烯酸酯)190719049.4218.61

(續(xù)表1)

No.FormulaComponentRetentionindexRelativecontent(%)RIexpRIlit[22]HS-SPMESD89C17H32O2(11Z)-11-Hexadecenoicacid,methylester((11Z)-11-十六碳烯酸甲酯)19101913-0.1190C17H34O2Hexadecanoicacid,methylester(棕櫚酸甲酯)192819265.9616.2191C16H30O2Palmitoleicacid(棕櫚油酸)19441951-0.7092C16H22O4Dibutylphthalate(鄰苯二甲酸二丁酯)19491965-0.2093C18H34O2Ethyl9-hexadecenoate(9-十六碳烯酸乙酯)197519770.967.6494C18H36O2Hexadecanoicacid,ethylester(十六酸乙酯)199619930.584.0995C20H30Dehydroabietane(脫氫松香烷)20512054-0.0796C21H42Heneicosene(二十一碳烯)20772089-0.0897C19H34O2Linoleicacid,methylester(亞油酸甲酯)209820923.1213.4198C19H36O29-Octadecenoicacid(Z)-,methylester((Z)-9-十八烯酸甲酯)210421033.1112.7899C19H36O213-Octadecenoicacid,methylester(13-十八碳烯酸甲酯)21022098-2.95100C19H36O211-Octadecenoicacid,methylester(11-十八碳烯酸甲酯)210921150.91-101C19H38O2Methylstearate(硬脂酸甲酯)21242128-1.11102C20H40O2Hexadecanoicacid,2-methylpropylester(十六酸2-甲基丙酯)21422135-0.11103C20H36O2Linoleicacidethylester(亞油酸乙酯)21562162-2.40104C20H38O2Ethyloleate(油酸乙酯)21632173-2.19105C20H38O2(E)-9-Octadecenoicacidethylester(反油酸乙酯)21702174-0.42106C20H40O2Octadecanoicacid,ethylester(硬脂酸乙酯)21912195-0.14107C21H40O2Pentylpalmitioleate(棕櫚油酸戊酯)22202226-0.24108C21H42O2Hexadecanoicacid,pentylester(棕櫚酸戊酯)2243--0.16109C23H46(Z)-9-Tricosene(順式-9-二十三烯)22712278-3.91110C20H42O1-Eicosanol(1-二十醇)227222810.31-111C22H42O4Hexanedioicacid,bis(2-ethylhexyl)ester(己二酸二(2-乙基己基)酯)240323980.44-112C22H46OBehenicalcohol(二十二醇)24722470-0.42

-：no detected

2.4 HS-SPME法與SD法提取揮發(fā)性組分比較分析

將HS-SPME法和SD法提取的沙棘揮發(fā)性成分結(jié)果進行比較(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法共鑒定出112種化合物，20種共同組分(庚醛、2-正戊基呋喃、檸檬烯、苯乙醛、芳樟醇氧化物、反式-呋喃芳樟醇氧化物、樟腦、藏花醛、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘、α-紫羅酮、α-姜黃烯、十五醛、肉豆蔻酸甲酯、植酮 、甲基十六碳-9-烯酸酯、棕櫚酸甲酯、9-十六碳烯酸乙酯、十六酸乙酯、亞油酸甲酯、(Z)-9-十八烯酸甲酯)，脂肪酸酯類和醛類化合物是沙棘揮發(fā)油的主要成分，分別占各自揮發(fā)性組分總量的33.09%(HS-SPME法)和74.90%(SD法)。在SD法中檢測到的相對含量超過10%的棕櫚酸甲酯、甲基十六碳-9-烯酸酯、亞油酸甲酯、(Z)-9-十八烯酸甲酯在HS-SPME法中的含量均超過3%，但是SD法中含量較高的9-十六碳烯酸乙酯(7.64%)和十六酸乙酯(4.09%)在HS-SPME法中的含量均不到1%。此外，HS-SPME法萃取物中醛類、酮類、烯烴類、醇類等化合物的種類及含量均高于SD法，如在HS-SPME法中含量較高的壬醛(9.40%)和糠醛(7.24%)在SD法中均未檢出。

根據(jù)以上分析可知，HS-SPME法和SD法提取的沙棘揮發(fā)性組分的種類及含量差異較大。HS-SPME法因萃取溫度較低，富集效果強，加熱時間短等特點，萃取的化合物種類較多，物質(zhì)組成比較均衡，更偏向于低沸點的醛類、酮類、萜烯類等化合物。而SD法提取過程中樣品浸泡和提取時間較長，加熱溫度高，可能使含量較低的組分損失，也易造成沸點低、揮發(fā)性強的組分流失[21]，所以提取的組分更傾向于高沸點的脂肪酸酯類化合物。因此，將兩種提取方法結(jié)合能夠獲得更加全面的沙棘揮發(fā)油信息，或者根據(jù)研究目的和用途選擇合適的前處理方法。

3 結(jié) 論

本研究優(yōu)化了HS-SPME法萃取沙棘揮發(fā)性成分的實驗條件，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜鑒定出76種揮發(fā)性組分。此外，研究還比較了HS-SPME法和SD法提取物的共性和差異，結(jié)果顯示，兩種方法提取的組分種類及含量差異較大，共鑒定出112種化合物，有20種共同組分，且酯類在兩種方法提取物中含量均較高。通過對比2種方法的提取化合物得出，HS-SPME法適合提取低沸點、易揮發(fā)的醛類、萜烯類等化合物，SD法更適合提取脂肪酸酯類等沸點較高的化合物。因此，結(jié)合2種方法共同分析沙棘的揮發(fā)性成分能夠得到更加全面的信息。本研究為沙棘揮發(fā)油的進一步研究奠定了基礎(chǔ)，為沙棘的快速檢測、真?zhèn)舞b定提供了技術(shù)保障。