劉 察，臧穎超，曾惠桃，范夏瓊，張志敏，盧紅梅

(中南大學(xué) 化學(xué)化學(xué)工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410083)

拉曼光譜技術(shù)是一種重要的分析檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，如古文物鑒定、生物蛋白質(zhì)研究、醫(yī)藥物質(zhì)檢測(cè)、食物安全現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等[1]。該技術(shù)無(wú)需復(fù)雜的樣本預(yù)處理，幾乎可以用于任何環(huán)境[2]。拉曼光譜還包含了豐富的物質(zhì)結(jié)構(gòu)信息，被稱為分子的“指紋圖譜”[3]。采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量學(xué)方法，可獲取隱藏在拉曼光譜中的定性和定量信息，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的定性檢測(cè)和定量分析。由于常規(guī)拉曼散射光強(qiáng)度約為入射光強(qiáng)度的10-6～10-9，這極大限制了拉曼技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)利用具有納米級(jí)粗糙度表面的金、銀等金屬可將拉曼信號(hào)放大一百萬(wàn)倍的特性[4-5]，設(shè)計(jì)了一系列金、銀以及復(fù)合金屬材料基底以顯著增強(qiáng)物質(zhì)拉曼信號(hào)[6-7]，使得SERS在分子檢測(cè)中具有良好的發(fā)展前景。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一種抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抗葉酸類抗腫瘤藥，可通過(guò)抑制二氫葉酸還原酶而降低四氫葉酸的形成并阻斷DNA 的合成，有效抑制滑膜細(xì)胞及免疫炎癥細(xì)胞的增殖，從而起到免疫抑制、抗炎、抗風(fēng)濕的作用，主要應(yīng)用于癌癥的治療。伏立康唑(Voriconazole，VOR)是一種通過(guò)抑制真菌中由細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的14α-甾醇去甲基化，從而抑制麥角甾醇的生物合成的廣譜抗真菌藥，對(duì)人和動(dòng)物的真菌感染均有治療作用。臨床醫(yī)療研究發(fā)現(xiàn)：MTX和VOR兩種藥物不同比例的混用會(huì)對(duì)小兒腫瘤患者產(chǎn)生強(qiáng)烈的副作用，并嚴(yán)重?fù)p害小兒腫瘤患者的皮膚。目前拉曼光譜技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)VOR的檢測(cè)分析。MTX固體的拉曼光譜圖無(wú)法獲取，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低功率的激光照射條件下，MTX物質(zhì)即出現(xiàn)灼燒情況。在VOR和MTX混合物的拉曼光譜中，VOR的拉曼光譜強(qiáng)度信號(hào)極低，難以找到特征拉曼光譜峰進(jìn)行鑒定分析。而且2種混合物的拉曼光譜存在重疊峰干擾，無(wú)法獲得特征光譜而使混合物的定性定量分析困難[8-9]。針對(duì)此問(wèn)題，可采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中的信號(hào)預(yù)處理算法以增強(qiáng)拉曼光譜分辨率，消除基線效應(yīng)[10-13]。Eiler等則提出一種高效算法，通過(guò)平滑分析信號(hào)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)峰位置的檢測(cè)[14-15]。Zhang等基于小波多分辨的優(yōu)勢(shì)，提出了小波空間多尺度峰檢測(cè)方法(Multi-scale peak detection，MSPD)[16]，該方法利用小波空間中的脊線、峰谷、零交叉點(diǎn)等信息進(jìn)行峰位置估計(jì)，并通過(guò)調(diào)整遺傳算法迭代次數(shù)和種群個(gè)數(shù)，得到峰位置和峰寬的最優(yōu)解[17]。彭穎等將MSPD方法與SERS技術(shù)相結(jié)合用于食品中違禁色素檢測(cè)，得到很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[18]。

本文針對(duì)MTX和VOX混合物快速定性檢測(cè)與半定量分析中存在的問(wèn)題，合成了一種金納米顆粒復(fù)合物(AuNPS-PPDA)作為SERS基底，利用SERS技術(shù)可獲得MTX和VOX混合物的高質(zhì)量光譜。針對(duì)SERS光譜重疊的問(wèn)題，本文提出了小波空間特征匹配(Feature matching in wavelet space,FMWS)方法，通過(guò)該方法可顯著減輕信號(hào)中基線變化和隨機(jī)噪聲的影響，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合物中目標(biāo)物質(zhì)的識(shí)別，及定性和半定量分析。

圖1 FMWS算法的流程圖
Fig.1 The procedure of FMWS

1 原 理

本文提出FMWS算法(見(jiàn)圖1)，該方法基于CWT原理進(jìn)行峰檢測(cè)，通過(guò)綜合運(yùn)用小波空間信息可準(zhǔn)確檢測(cè)特征峰位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的定性檢測(cè)。再提取特征峰強(qiáng)、峰面積等信息，基于非負(fù)最小二乘算法實(shí)現(xiàn)對(duì)甲氨喋林和伏立康唑的半定量分析。

1.1 連續(xù)小波變換峰檢測(cè)

小波是基于一系列具有連續(xù)可微、零均值等特性的函數(shù)基礎(chǔ)上形成的多尺度信號(hào)分析方法，其表達(dá)式如下：

(1)

式中，a為尺度因子，b為平移因子?？梢钥闯墒切盘?hào)s(t)與小波函數(shù)Ψ的卷積，定義如下：

(2)

采用如下步驟可以利用CWT將SERS光譜轉(zhuǎn)換至小波空間，并提取高質(zhì)量特征：

①小波基的選擇：由分析儀器產(chǎn)生的特征峰有較高的局部特征，色譜信號(hào)多為高斯峰，光譜信號(hào)多為洛倫茲峰，因此本研究選擇的墨西哥帽函數(shù)具有近似對(duì)稱、與高斯峰相似的特點(diǎn)，選擇墨西哥帽小波作為小波函數(shù)；

②小波空間中的脊線、峰谷、零交叉點(diǎn)：在二維小波空間中，脊線、峰谷、零交叉點(diǎn)等重要特征參數(shù)可以很容易被確定；

③峰位置的確定：綜合利用脊線、峰谷、零交叉點(diǎn)可確定峰位置、起始點(diǎn)；

④脊線閾值：通過(guò)脊線最大值設(shè)置閾值，去除假峰；

⑤峰強(qiáng)與峰面積的提?。和ㄟ^(guò)提取峰強(qiáng)、峰面積等信息，用于后續(xù)小波空間特征匹配。

小波系數(shù)C為二維矩陣，行和列分別代表尺度因子和平移因子。將矩陣C分別平移k，k-1，...1以及-k，-(k-1)，...，-1列，分別作為矩陣kC和矩陣-kC。脊線、峰谷和零交叉點(diǎn)可通過(guò)以下的布爾代數(shù)方程得到：

R=(C>-kC)∧(C>-(k-1()C)...(C>k-1C)∧(C>kC)

V=(C<-kC)∧(C<-(k-1)C)...(C

Z=[sgn(c1)⊕sgn(c0),…sgn(cn)⊕sgn(cn-1)]

(3)

R，V，Z為分別包含脊線、峰谷和零交叉點(diǎn)信息的矩陣。取出R中的列計(jì)算元素和，如果列求和為0，則這一列沒(méi)有脊線，如果列求和大于0，則這列中可能有脊線。然后從小尺度系數(shù)到大尺度系數(shù)增加行值,從初始位置掃描矩陣R。重復(fù)提取過(guò)程，直至矩陣R最后一行元素值全為0，則說(shuō)明列中的脊線已經(jīng)提取完全。若小波系數(shù)大于0，則為單峰。小波系數(shù)小于0，則可能為重疊峰。搜索矩陣V，Z進(jìn)行雙向搜索。遇到非0值時(shí)，作為峰的起止點(diǎn)，將搜索過(guò)程中非0值的列保存。在原始信號(hào)中，最大值列和最小值列分別對(duì)應(yīng)峰的起止點(diǎn)，其間的最大值列對(duì)應(yīng)峰的位置。

1.2 小波空間特征匹配

HQI是一種正向光譜檢索方法，它以參考物光譜與未知光譜的匹配系數(shù)的大小，決定是否有特征物質(zhì)存在。其HQI值越大，說(shuō)明未知光譜與參考物光譜的相似度越高。該方法主要適用于純物質(zhì)光譜分析，而對(duì)混合物光譜，雜峰存在下的未知光譜的匹配則不穩(wěn)健，其HQI值易受雜峰因素的干擾。FMWS算法則不受該因素限制，在檢索未知光譜時(shí)，只選取對(duì)應(yīng)特征峰強(qiáng)信息進(jìn)行匹配，而自動(dòng)忽略其他雜峰、重疊峰的干擾。其FMWS越接近于1，則說(shuō)明未知光譜與參考物光譜越接近。

(4)

HL，HU∩L為向量，HU∩L為參考物光譜L與未知物對(duì)應(yīng)的特征峰光譜U。HL，i為參考物光譜第i特征峰的特征匹配系數(shù)，HU∩L為參考物光譜L與未知物光譜U的第i特征匹配系數(shù)。

1.3 非負(fù)最小二乘半定量算法

本文研究的混合物光譜，y即為混合物光譜，X為矩陣，矩陣的列代表未知化合物。b為未知化合物在混合物中占比的向量。通過(guò)設(shè)置閾值可以消除雜質(zhì)峰譜的干擾，用非負(fù)最小二乘算法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知混合物組分的半定量分析。統(tǒng)一混合物與光譜庫(kù)中可能存在組分的拉曼光譜積分時(shí)間，近似計(jì)算出混合物的比例。其表達(dá)式如下：

min‖y-Xb‖≥0,bi≥0

(5)

式中的非負(fù)最小二乘問(wèn)題可等價(jià)于如下二次規(guī)劃問(wèn)題：

(6)

式中，Q=XTX，c=-XTy。本文基于Lawson和Hanson[19]提出的有效集非負(fù)最小二乘方法對(duì)混合物中的組分進(jìn)行半定量分析。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料與儀器

氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸鈉，聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)、MTX、VOR(分析純，上海Sigma-Aldrich公司);實(shí)驗(yàn)所用超純水(18.25 MΩ·cm)均來(lái)自Milli-Q凈水系統(tǒng)(Bedford,MA,USA)。實(shí)驗(yàn)中未特別指明，均在室溫下進(jìn)行。

B&W Tek i-Raman拉曼光譜儀(B&W Tek Inc.,Newark,DE,USA)，激發(fā)光源波長(zhǎng)為785 nm，激光功率為30 mW;拉曼位移范圍為222～2 478 cm-1;Tescan MIRA 3 XMU SEM(Tescan USA Inc.,Cranberry Township,PA,USA)獲取金納米的微觀形貌圖。

2.2 金納米顆粒的制備

金納米粒子采用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備[20]：將1mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50 mL 1%檸檬酸鈉溶液中，在100 ℃條件下，磁力攪拌反應(yīng)20 min，當(dāng)混合溶液從淺黃色逐漸變?yōu)槊髁恋孽r紅色后，停止反應(yīng)，將混合液自然冷卻并倒入用錫紙密封的錐形瓶中，完成50 nm的金納米(AuNPS)制備[21]。同樣條件下，將0.6 mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50mL 1% 檸檬酸鈉溶液中，自然冷卻即得尺寸為70 nm的金納米(AuNPS)。

2.3 AuNPS-PDDA納米復(fù)合材料的制備

將1 mL PDDA與9 mL水置于燒杯中超聲處理5 min，使其充分混合后，再量取30 mL AuNPS溶液至燒杯中。40 mL混合液在8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心機(jī)下離心15 min，移除上清液，得到2 mL AuNPS-PDDA。

2.4 MTX和VOR混合物的快速SERS檢測(cè)

100 μL不同濃度的MTX和VOR樣品與100 μL AuNPS-PDDA混合超聲處理10 min,每次用移液槍移取10 μL混合液緩慢均勻滴于硅膠板上檢測(cè)，每1批次滴5個(gè)樣品做平行檢測(cè)，光譜采集的時(shí)間為30 s，即得到MTX和VOR混合物的表面增強(qiáng)拉曼光譜圖。

2.5 MTX和VOR混合物的濃度梯度實(shí)驗(yàn)

取0.1 mg/mL VOR(2.86 ×10-4mol/L)分別與不同MTX濃度(1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol/L)混合，得到6組混合物。每次移取10 μL樣本滴于硅膠板上進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米顆粒形貌特征

圖1A、B分別為50 nm和70 nm金納米的掃描電鏡圖。由圖可看出，50 nm的金納米分散均勻，未出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，而70 nm的金納米粒子分散不均勻，且出現(xiàn)部分團(tuán)聚，說(shuō)明50 nm尺寸的金納米穩(wěn)定性能優(yōu)于70 nm尺寸的金納米，本實(shí)驗(yàn)采用50 nm尺寸的金納米基底進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.2 MTX和VOR的拉曼光譜圖

由圖3可以看出，VOR的常規(guī)拉曼圖譜信號(hào)強(qiáng)度較低，只有2 500。借助表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，其730 cm-1特征峰的強(qiáng)度值可大于10 000。其中，730 cm-1為季碳的伸縮振動(dòng)峰，1 050 cm-1為環(huán)內(nèi)NCN的伸縮振動(dòng)峰。本實(shí)驗(yàn)用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原氯金酸獲取金納米的方法，使用強(qiáng)陽(yáng)離子聚電解質(zhì)PDDA，得到帶正電荷的金納米基底，利用正負(fù)電荷結(jié)合的原理，采用堿液溶解藥物可以使藥物分子結(jié)合在金納米表面。在入射光激發(fā)下，金納米顆粒表現(xiàn)出強(qiáng)烈的表面等離子體共振特性。具有很強(qiáng)的局域電場(chǎng)，使得處于該電場(chǎng)中的MTX和VOR分子的拉曼散射被增強(qiáng)。因此可以得到藥物分子信號(hào)顯著增強(qiáng)的拉曼特征圖譜。

圖3 VOR的拉曼光譜及表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.3 Raman and SERS spectra of VOR

圖4 MTX、VOR及MTX-VOR的表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.4 SERS spectra of VOR,MTX and MTX-VOR

圖5 混合物中改變MTX濃度的表面增強(qiáng)拉曼光譜Fig.5 SERS spectra of mixture with different MTX concentrations

按“2.4”考察了MTX和VOR混合物的SERS譜圖(見(jiàn)圖4)。由圖4可以看出：MTX和VOR純物質(zhì)的SERS光譜在MTX-VOR混合物的SERS光譜中均能找到，VOR的SERS光譜也可測(cè)出。說(shuō)明借助SERS技術(shù)可以成功檢測(cè)出MTX、VOR、MTX-VOR光譜。按“2.5”采用SERS技術(shù)進(jìn)一步考察了MTX和VOR混合物的濃度梯度實(shí)驗(yàn)。從圖5可看出，混合物中0.1 mg/mL VOR(2.86×10-4mol/L)與1.0×10-8mol/L MTX均可被成功識(shí)別。此外，采用SERS技術(shù)還可很容易地區(qū)分出混合物中各組分的拉曼特征峰，其中680 cm-1為MTX苯環(huán)上的C—H 面外彎曲振動(dòng)峰，1 345 cm-1為—CH3伸縮振動(dòng)峰。730 cm-1和1 345 cm-1分別為VOR和MTX的拉曼特征峰。

3.3 混合物中VOR和MTX的定性結(jié)果

利用小波空間中脊線、峰谷、零交叉點(diǎn)信息，通過(guò)設(shè)置脊線最大值閾值可以排除假峰，提升峰檢測(cè)的準(zhǔn)確度。混合藥物的分析信號(hào)數(shù)據(jù)集包括VOR和MTX的信號(hào)、基線、隨機(jī)噪聲。因?yàn)樾〔ㄊ菍?duì)稱、零均值、變化緩慢、局部基線單調(diào)的函數(shù)，所以在“1.1”小波峰檢測(cè)計(jì)算過(guò)程中會(huì)自動(dòng)扣除局部緩慢變化的基線。FMWS可以認(rèn)為是分析信號(hào)與尺度交換、平移后小波的卷積，因此可以壓縮小波空間的噪聲。利用小波提取到拉曼特征后，由VOR和MTX的SERS單一光譜進(jìn)行定性匹配?；旌纤幬锏腟ERS光譜樣本共有18組數(shù)據(jù)，即VOR濃度變化范圍為0.1、0.01、0.001 mg/mL(即2.86×10-4、2.86×10-5、2.86×10-6mol/L)，MTX為1.0×10-3～1.0×10-8mol/L。分別以VOR和MTX的SERS光譜進(jìn)行匹配計(jì)算，即可分別得到VOR(表1)和MTX(表2)的定性結(jié)果。FMWS相比于HQI方法，選取目標(biāo)物的峰位置信息進(jìn)行匹配，可自動(dòng)忽略、排除其他雜峰等因素的干擾，即公式(4)計(jì)算出的FMWS值理論上明顯高于HQI值。即采用小波空間特征匹配算法，可計(jì)算出混合物與標(biāo)準(zhǔn)品的SERS光譜匹配度。結(jié)果表明，混合物中的VOR和MTX的特征匹配系數(shù)值均大于0.96，且大部分的結(jié)果達(dá)到0.99，各組對(duì)應(yīng)數(shù)值均大于HQI值。說(shuō)明小波空間特征匹配方法可成功檢出混合物的組分，且其準(zhǔn)確性高于傳統(tǒng)命中質(zhì)量系數(shù)法。

3.4 混合物中VOR和MTX的半定量結(jié)果

由于重疊峰、密集峰、基線以及噪音等干擾因素，利用單個(gè)特征峰難以準(zhǔn)確定量混合物中的組分含量。本研究依據(jù)VOR和MTX參考光譜數(shù)據(jù)，充分利用未知混合光譜全譜信息，采用非負(fù)最小二乘方法進(jìn)行分析。即分別提取出VOR和MTX對(duì)應(yīng)的730 cm-1和1 345 cm-1拉曼特征峰位置、峰強(qiáng)信息。對(duì)18組混合物的SERS光譜進(jìn)行半定量分析?；旌衔锕庾Vy，矩陣X一列是一個(gè)候選化合物VOR的光譜，一列是候選化合物MTX的光譜，b為候選化合物比例的向量。通過(guò)非負(fù)最小二乘可以計(jì)算出兩者在混合物中的比例，并將其與真實(shí)占比進(jìn)行對(duì)比(表3)。結(jié)果表明，混合物的各組分含量比可以進(jìn)行定量，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值之間相關(guān)性大于0.98。說(shuō)明小波空間特征匹配結(jié)合非負(fù)最小二乘方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知混合物中VOR和MTX組分的半定量分析。

表1 小波空間特征匹配系數(shù)與命中質(zhì)量系數(shù)對(duì)不同濃度VOR的定性結(jié)果Table 1 FMWS and HQI of VOR with different concentrations in mixture

表2 小波空間特征匹配系數(shù)與命中質(zhì)量系數(shù)對(duì)不同濃度MTX的定性結(jié)果Table 2 FMWS and HQI of MTX with different concentrations in mixture

表3 小波空間特征匹配對(duì)混合物組分VOR和MTX的定量結(jié)果Table 3 Quantitative analysis results of VOR and MTX mixture by FMWS

4 結(jié) 論

本研究合成了AuNPS-PDDA納米復(fù)合物，借助SERS的表面增強(qiáng)效應(yīng)，成功地定性和半定量分析混合物中的組分甲氨蝶呤(MTX)和伏立康唑(VOR)。針對(duì)重疊峰、密集峰、弱峰、基線以及噪音等干擾因素導(dǎo)致組分無(wú)法檢出與準(zhǔn)確定量這一難題，將小波信息轉(zhuǎn)換至小波空間中進(jìn)行峰檢測(cè)，確定混合物中的物質(zhì)成分，然后利用全譜信息進(jìn)行半定量分析。該算法可以準(zhǔn)確確定出混合物中組分，能預(yù)測(cè)其組分含量比例。結(jié)果表明，SERS技術(shù)結(jié)合小波空間特征匹配以及非負(fù)最小二乘方法可實(shí)現(xiàn)MTX和VOR的定性和半定量分析。