方 靈，韋 航，黃 彪，劉文靜，蘇德森，吳妙鴻，傅建煒

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，福建 福州 350003)

抗生素主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌性感染類疾病，促進(jìn)畜禽健康生長(zhǎng)，以提高養(yǎng)殖質(zhì)量和效率。在奶牛養(yǎng)殖中，抗生素主要用于治療乳牛乳腺炎、腹瀉等疾病[1-2]。泌乳期乳牛若過(guò)量使用抗生素或休藥期不足，可能導(dǎo)致牛奶中殘留抗生素，并通過(guò)食物鏈對(duì)人體健康造成不良影響，如引起胃腸不適、過(guò)敏反應(yīng)、肝功能損害等[3-6]。此外，濫用抗生素或長(zhǎng)期攝入含抗生素食品可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[7-8]，對(duì)人類健康危害更加嚴(yán)重，同時(shí)，抗生素殘留對(duì)環(huán)境中微生物群落也會(huì)產(chǎn)生影響，并通過(guò)食物鏈影響高級(jí)生物，破壞生態(tài)系統(tǒng)[9]。為保障食品安全，我國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告規(guī)定了動(dòng)物源性食品中抗生素的最大殘留限量(MRL)[10]，許多國(guó)家及組織也制定了抗生素最大殘留限量，限量標(biāo)準(zhǔn)日益嚴(yán)格。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的食品中抗生素檢測(cè)方法十分必要。

目前，抗生素的檢測(cè)方法主要有微生物法、生物傳感法[11-12]、酶聯(lián)免疫法[13-14]、液相色譜法[15-17]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[18-21]等。但微生物法、生物傳感法及酶聯(lián)免疫法的特異性不高，靈敏度較差；液相色譜法存在檢測(cè)抗生素種類有限、檢出限高等缺點(diǎn)。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)因分析效率高、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，成為抗生素殘留分析的主流檢測(cè)方法。王浩等[21]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在30 min內(nèi)測(cè)定了牛奶中5類35種抗生素殘留，李寧等[19]開(kāi)發(fā)了牛奶中4類25種抗生素殘留的檢測(cè)方法。但已有方法存在操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)抗生素種類或數(shù)量相對(duì)較少，以及不適于樣品快速篩查分析的不足?？股貧埩魡?wèn)題日漸突出，由此帶來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了社會(huì)公眾廣泛關(guān)注，為確保我國(guó)食品和環(huán)境安全，探索一種快速、高效、靈敏的多種類抗生素殘留同時(shí)測(cè)定方法迫在眉睫。

本文以奶牛養(yǎng)殖業(yè)中常用的抗生素為研究對(duì)象，針對(duì)不同種類抗生素理化性質(zhì)的差異，優(yōu)化了提取溶劑和凈化條件，考察了基質(zhì)效應(yīng)，建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中5類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類)38種抗生素殘留的UPLC-MS/MS方法。本方法成功應(yīng)用于實(shí)際牛奶樣品中目標(biāo)抗生素的測(cè)定，可為牛奶中多類別、多組分抗生素的快速篩查提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC H-Class Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司)；渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)；HGC-36A氮吹儀(天津恒奧有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Anke TDL-5-A離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q 超純水器(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液；量取各單標(biāo)儲(chǔ)備液0.1 mL至同一10 mL容量瓶中，以甲醇定容并混勻，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于-20 ℃下密閉保存。準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成系列空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g牛奶樣品至15 mL 聚丙烯離心管中，加入5 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸乙腈溶液，渦旋振蕩后超聲10 min，以5 000 r/min 離心5 min，取上清液，待凈化。

Oasis PRiME HLB固相萃取小柱經(jīng)5 mL乙腈-水溶液(體積比1∶1)活化平衡后，上樣，流速為1 mL/min，用5 mL乙腈-水溶液(1∶1)洗脫，收集流出液，在40 ℃下氮吹近干，用初始流動(dòng)相溶解并定容至1 mL，過(guò)0.22 μm濾膜后，待UPLC-MS/MS分析。

1.4 液相色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)；流速：0.4 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0～0.20 min，95%A；0.20～2.50 min，95%～50%A；2.50～4.50 min，50%～5%A；4.50～4.51 min，5%～95%A；4.51～8.00 min，95%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；待測(cè)磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為正離子模式，毛細(xì)管電壓：2.5 kV；氯霉素類抗生素為負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓：-2.5 kV；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)檢測(cè)；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：600 ℃；脫溶劑氣和錐孔氣均為氮?dú)猓魉俜謩e為1 000、150 L/h；碰撞氣為氬氣(純度> 99.999%)，流速為0.15 mL/min。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

5類抗生素在不同離子模式下的響應(yīng)不同，磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在正離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)，而氯霉素類在負(fù)離子模式下響應(yīng)較強(qiáng)。因此，本研究選擇正、負(fù)離子模式同時(shí)監(jiān)測(cè)以提高效率。

考察了Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm)和Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)對(duì)38種抗生素的分離效果。結(jié)果顯示，經(jīng)Acquity UPLC HSS T3色譜柱分離后38種抗生素的峰形相對(duì)更佳，這是由于HSS T3柱為硅膠基質(zhì)色譜柱，適用于較寬極性范圍的物質(zhì)分析，對(duì)于同時(shí)分析多種目標(biāo)物的效果相對(duì)較佳。

通過(guò)質(zhì)譜掃描分析，分別對(duì)各抗生素進(jìn)行正離子、負(fù)離子掃描，確定各目標(biāo)物的分子離子，再對(duì)分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描(子離子掃描)，對(duì)錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)強(qiáng)度較高的子離子為特征離子。設(shè)定駐留時(shí)間及采集通道，確保色譜峰采集點(diǎn)數(shù)在12點(diǎn)以上，以得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。各抗生素的母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

(續(xù)表1)

ClassCompoundRetentiontime(min)Precursorion(m/z)Production(m/z)Conevoltage(V)Collisionenergy(eV)Sparfloxacin(SPA,司帕沙星)3.72393.3292.1/349.3?3724/20Orbifloxacin(ORB,奧比沙星)3.47396.1295.1?/352.14022/14Difloxacin(DIF,雙氟沙星)3.43400.2282.2?/356.13727/21Oxolinicacid(OXO,喹酸)4.14262.0216.0?/244.03030/19Flumequine(FLU,氟甲喹)4.45262.1202.0/244.0?3535/15TetracyclinesDoxycycline(DXC,強(qiáng)力霉素)4.08445.2154.0/428.2?3020/28Tetracycline(TC,四環(huán)素)3.28444.7410.2?/427.33018/14Oxytetracycline(OTC,土霉素)3.33460.7426.2?/444.23418/18Chlortetracycline(CTC,金霉素)3.82479.3444.2?/462.23020/18ChloramphenicolsChloramphenicol(CAP,氯霉素)4.03320.9152.2?/257.2588/16Thiamphenicol(TAP,甲砜霉素)3.14354.1184.9?/226.96018/12Florfenicol(FFC,氟苯尼考)3.60356.2185.1/336.0?5816/8MacrolidesErythrocin(ERY,紅霉素)4.33734.5158.1?/576.53032/20Roxithromycin(ROX,羅紅霉素)4.47937.6158.1?/679.54035/20

*quantitative ion

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化抗生素殘留分析的常用提取溶劑為乙腈、乙腈-水溶液、酸化乙腈等[22-23]。乙腈為中等極性溶劑，與多數(shù)抗生素的極性接近，且能使蛋白質(zhì)變性沉淀。分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈5種提取溶劑對(duì)目標(biāo)抗生素的提取效率。在空白牛奶樣品中添加38種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照相同方法分析處理，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果顯示，采用0.5%甲酸乙腈提取時(shí)，38種抗生素的平均回收率相對(duì)較高，回收率為76.1%～ 91.0%。因此選擇0.5%甲酸乙腈為提取溶劑。

圖1 不同凈化方法對(duì)38種抗生素回收率的影響Fig.1 Effect of different purification method on recoveries of 38 antibiotics

2.2.2 凈化方法的優(yōu)化牛奶中富含的蛋白質(zhì)及脂肪不僅會(huì)干擾目標(biāo)物的分析，也會(huì)影響色譜柱壽命，因此需對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。分別比較了Oasis PRiME HLB、C18固相萃取小柱和QuEChERS試劑管對(duì)目標(biāo)抗生素的凈化效果(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，經(jīng)Oasis PRiME HLB柱凈化后，大部分目標(biāo)化合物的回收率高于C18柱和QuEChERS試劑管。這可能是由于Oasis PRiME HLB柱中親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮聚合成的固相填料可以很好地吸附脂質(zhì)，凈化效果相對(duì)較好，因此選擇Oasis PRiME HLB柱凈化樣品。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)是基質(zhì)中除目標(biāo)物以外的其他成分對(duì)目標(biāo)物分析的影響。由于其他成分與目標(biāo)組分在離子化過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)，改變了目標(biāo)物的電離效率，使目標(biāo)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度降低或增強(qiáng)，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)考察空白樣品基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)強(qiáng)度(A)與純?nèi)軇┲邢嗤瑵舛葮?biāo)準(zhǔn)溶液信號(hào)強(qiáng)度(B)的比值來(lái)評(píng)價(jià)本方法的基質(zhì)效應(yīng)，即ME=A/B×100%。結(jié)果顯示，大部分目標(biāo)抗生素存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，其中諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、丹諾沙星、沙拉沙星以及4種四環(huán)素類抗生素存在較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，少部分抗生素存在輕微的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。

圖2 空白牛奶樣品中38種抗生素的總離子流圖(定量下限加標(biāo)水平)Fig.2 Total ion chromatogram of 38 antibiotics in a blank milk sample(spiked with LOQ level)

2.4 線性范圍與定量下限

根據(jù)每種抗生素的響應(yīng)值，配制系列質(zhì)量濃度的空白樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。以定量離子10倍信噪比(S/N=10)得到定量下限(LOQ)，方法的線性范圍、LOQ結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，38種目標(biāo)抗生素在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，LOQ為0.10～1.0 μg/kg。

2.5 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白牛奶基質(zhì)中分別添加1.0、5.0、10.0 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照相同方法處理后進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表2可知，在3個(gè)加標(biāo)水平下，38種目標(biāo)抗生素的平均回收率為70.7%～ 94.9%，RSD為4.0%～ 9.4%。在LOQ加標(biāo)水平下，空白牛奶基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物后的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，該方法能滿足牛奶中38種抗生素殘留的日常檢測(cè)要求。

表2 38種抗生素的線性范圍、定量下限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,LOQs,recoveries and relative standard deviations of 38 antibiotics(n=6)

2.6 實(shí)際樣品分析

表3 牛奶樣品中抗生素的含量(n=3)Table 3 Contents of antibiotics in milk samples(n=3) w/(μg·kg-1)

*average value±standard deviation；**not detected

3 結(jié) 論

本研究建立了UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定牛奶中5類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類)38種抗生素殘留的分析方法，對(duì)提取溶劑、凈化方式等因素進(jìn)行了優(yōu)化。在最佳條件下，38種抗生素在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，LOQ為0.10～1.0 μg/kg，在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為70.7%～ 94.9%，RSD為4.0%～9.4%，各指標(biāo)均滿足分析檢測(cè)的要求。該方法對(duì)于牛奶中多類別、多組分抗生素殘留的分析監(jiān)測(cè)、快速篩查具有參考意義。