曾 真，喻佳俊，劉 平，黃正旭，高 偉，李 梅，周 振，李 磊*

(1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣東 廣州 510632；2.廣州禾信康源醫(yī)療科技有限公司，廣東 廣州 510530)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是近年來發(fā)展起來的一種生物質(zhì)譜[1]，該技術(shù)通過檢測微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜來鑒定微生物[2-5]，具有快速、準確、靈敏、自動化及高通量等特點[6]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、生物防御、環(huán)境監(jiān)測和食品質(zhì)量控制等領(lǐng)域。

靶板用來承載待檢測的樣品和基質(zhì)，是MALDI-TOF MS的重要組成部分。靶板的使用材料以及制作工藝對質(zhì)譜儀的性能有很大影響，目前市面上所用的靶板主要為可重復(fù)使用的不銹鋼靶板。臨床診斷對醫(yī)療器械和用具的清潔程度有很高的要求[7]，例如尿檢、血檢等使用的都是一次性可丟棄的塑料管，非一次性的用具在使用之前也有一系列的消毒規(guī)范[8]。一方面要避免殘留物影響檢測結(jié)果，另一方面也要給患者和醫(yī)護人員提供安全良好的醫(yī)療環(huán)境，避免病源的交叉感染[9]。不銹鋼靶板最主要的缺點就是每次使用完均需使用丙酮等有機溶液清洗[10]，過程繁瑣且易有殘留，不僅耗費大量時間，稍有不慎還會影響診斷的結(jié)果?？蓲仐壍囊淮涡园邪迨桥R床應(yīng)用的發(fā)展方向，Schurenberg 等[11]提出的一種一次性塑料靶板獲得了較為廣泛的應(yīng)用，但塑料材料難降解，使用完后仍不易處理，若將帶有致病菌的塑料靶板隨意丟棄，會對土壤或水環(huán)境造成一定的污染[12]。近年來，基于紙開展的科學(xué)研究工作越來越多，Whitesides等[13]首次提出將紙作為微流控技術(shù)芯片，代替常規(guī)的玻璃、硅、石英、高聚物等材料，使微流控芯片的成本降低并可作為一次性分析器件使用。Wang等[14]第一次將紙應(yīng)用于質(zhì)譜領(lǐng)域作為電噴霧電離源的基質(zhì)和載體，被稱為紙噴霧電離技術(shù)。該技術(shù)具有快速、低廉、高效等特點，已被用于血樣、尿樣、食品、生物組織樣品、藻類等樣品的快速分析檢測[15-18]。鑒于此，本團隊開發(fā)了一種用于MALDI-TOF MS的紙基靶板。該靶板相比于普通鋼靶板的優(yōu)點在于：(1)成本低且便于攜帶和運輸；(2)使用完后可以直接更換，節(jié)省了清洗所耗費的時間；(3)一次性使用，可以避免之前的殘留物影響檢測結(jié)果；(4)由于液體在紙上具有擴散性，只需少量的樣品就可以擴散整個靶點，使樣品的消耗量更少。與普通的塑料一次性靶板相比：(1)紙質(zhì)靶板制作工藝更加簡單，在實驗室即可自行制備，隨用隨制，成本低廉；(2)用后焚毀不會對土壤或水環(huán)境造成污染。本文通過對比同種樣品在紙基靶板與不銹鋼靶板上檢測時譜圖的分辨率、靈敏度、重現(xiàn)性，證實了紙基靶板能替代常用的鋼靶板；實際細菌檢測結(jié)果表明，該紙基靶板具有用于臨床微生物檢測的潛力。

1 實驗部分

1.1 實驗樣品

緩激肽1-7(B4181,Bradykinin Fragment 1-7,756.40 Da)、血管緊張素Ⅱ(A8846,Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、促腎上腺皮質(zhì)激素肽段18-39(A8346,ACTH Fragment 18-39,2 464.20 Da)、胰島素(I6279,Insulint,5 729.61 Da)、細胞色素C(C8857,Cytochrome C,12 361.96 Da)、肌紅蛋白(A8971,Apomyoglobin,16 951.30 Da)、牛血清白蛋白(A8471,BSA,66 429 Da)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(C8982,CHCA)、0.1%三氟乙酸(T3443,TFA)、乙腈(A8596,ACN)，均購于Sigma Aldrich公司。

混合多肽校準品Peptide Calibration StandardI(#206195,BrukerDaltonics)和混合蛋白校準品Protein Calibration StandardI(#206355,BrukerDaltonics)均來源于德國布魯克道爾頓公司；大腸桿菌由北京鑫匯普瑞科技發(fā)展有限公司惠贈。所用實驗純凈水均由Milli-Q系統(tǒng)產(chǎn)生。

基質(zhì)CHCA利用乙腈-三氟乙酸-水(50∶2.5∶47.5,體積比)混合溶劑溶解，配成CHCA的飽和溶液。標(biāo)準蛋白、多肽樣品根據(jù)所需濃度利用0.1%三氟乙酸溶液配制而成。處理微生物樣品時，從培養(yǎng)基上挑選3～4個單菌落，加入300 μL的滅菌純水和700 μL的無水乙醇混勻，離心后棄去上清液，再次離心，去除殘余的上清液，加入70%甲酸水溶液-乙腈(1∶1,體積比)20 μL，充分混勻后離心，取上清液進行實驗。所有樣品均采用覆蓋點樣法，即每個點位先點1.0 μL樣品，干燥后再覆蓋1.0 μL基質(zhì)，自然風(fēng)干后上機待用。

1.2 紙靶板的制作

紙基材質(zhì)因吸水性、孔徑、纖維粗細等參數(shù)不同而具有不同的特性。本實驗選擇Whatman No.1濾紙[19]作為制作紙基靶板的材料。此濾紙具有空隙均勻、顆粒保留效果良好等優(yōu)點，且溶劑的作用會使纖維素膨脹從而減小毛細管作用力，降低甚至阻止液體的滲透和流動，有利于樣品的聚集。

圖1 紙基靶板實物圖Fig.1 The picture of the real paper-based plate

紙基靶板的制作采用手繪蠟印技術(shù)[20-22]。具體步驟如下：(1)模具設(shè)計：根據(jù)所需靶點的尺寸及數(shù)量利用不飽和聚酯樹脂制作熱固性塑料模具，模具上圓點的尺寸和數(shù)量均可由用戶根據(jù)需求自行設(shè)計。本實驗儀器采用的模具點尺寸與標(biāo)準96孔靶板一致，孔橫縱間距均為4 mm，孔直徑為3 mm，模具中圓點部分無孔緊實，圓點周邊呈網(wǎng)紗質(zhì)地，以使蠟?zāi)軡B透。(2)壓模與涂蠟：將上述模具覆蓋在濾紙上，用蠟筆將整個模具描滿，使模具和濾紙成一整體。(3)壓實：用不銹鋼片來回壓實蠟筆描摹區(qū)域，使蠟體穩(wěn)定地附著在濾紙表面。需特別注意，在來回壓實的過程中，需用力重復(fù)壓實動作10～20次，才能使蠟體較好地附著在濾紙表面。(4)熱印：將粘連的模具和濾紙整體放置在高溫爐(大約150 ℃)上加熱2～3 s，使每個孔位周邊區(qū)域的蠟滲透至濾紙上，在濾紙上形成孔位親水和外周疏水的靶板(圖1)。

1.3 實驗方法

利用蛋白及多肽樣品對比紙基靶板與鋼靶板的分辨率和靈敏度，并測試紙基靶板的重現(xiàn)性，從而驗證紙基靶板使用的可行性。采用10 pmol/μL的激緩肽、血管緊張素Ⅱ、促腎上腺激素肽段18-39、胰島素、細胞色素C、肌紅蛋白、牛血清白蛋白，對比考察紙基靶板與鋼靶板在同種實驗條件下質(zhì)譜儀的分辨率情況。分辨率均為5次獨立測試結(jié)果的平均值。靈敏度則利用10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA進行對比，計算各濃度下BSA 3個離子峰的信噪比(取5次實驗結(jié)果的平均值)，BSA的3個離子峰包括母體離子峰(m/z66 430)、雙電荷離子峰(m/z33 216)、三電荷離子峰(m/z22 144)。再利用Peptide Calibration StandardI(離子峰質(zhì)量分布在1 000～4 000 Da之間)檢驗紙基靶板的重現(xiàn)性，Peptide Calibration StandardI包含血管緊張素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ,1 295.68 Da)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,1 045.54 Da)、物質(zhì)P(Substance P,1 346.74 Da)、鈴蟾肽(Bombesin,1 618.82 Da)、促腎上腺激素1-17(ACTH clip 1-17,2 092.09 Da)、促腎上腺激素18-39(ACTH Clip 18-39,2 464.20 Da)、生長激素抑制素28(Somatostatin 28,3 146.47 Da)7種多肽。最后將紙基靶板實際應(yīng)用于大腸桿菌的鑒定。

MALDI-TOF MS為實驗室自制的直線式基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀[23]。所有譜圖均在正離子模式下得到，離子加速電壓為22 kV，所用激光波長為343 nm，頻率為20 Hz，能量為出峰的臨界值。每張譜圖為激光出射200次的疊加圖譜。使用標(biāo)準蛋白混合物Protein Calibration StandardI和標(biāo)準多肽混合物Peptide Calibration StandardI校準質(zhì)譜儀。微生物鑒定數(shù)據(jù)庫由北京鑫匯普瑞科技發(fā)展有限公司提供。

圖2 紙基靶板(A)和不銹鋼靶板(B)上BSA(10 pmol/μL)與CHCA基質(zhì)的共結(jié)晶圖Fig.2 Crystal of BSA(10 pmol/μL) and CHCA matrix on paper-based plate(A) and stainless steel plate(B)

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶情況

圖2A和圖2B分別為紙基靶和鋼靶板上1 μL牛血清白蛋白(10 pmol/μL)與1 μL CHCA基質(zhì)的共結(jié)晶圖。由圖可看出紙基靶板上由于樣品與基質(zhì)的結(jié)晶顆粒被紙纖維阻擋不能輕易流動，故結(jié)晶范圍局限在1 mm內(nèi)，類似于AnchorChip的靶板效果[24]，可以使儀器具有較高的靈敏度及信號重現(xiàn)性。鋼靶板上結(jié)晶體稀疏的分布在靶圈內(nèi)，沒有聚集效果，檢測時會由于分布不均勻，導(dǎo)致不同區(qū)域的信號強度相差較大，重現(xiàn)性較差。

圖3 分辨率比較圖Fig.3 Comparison of the resolutionA.peptides,B.proteins,C.BSA

2.2 質(zhì)量分辨率的對比

質(zhì)量分辨率(以下簡稱分辨率)對比情況如圖3所示。在700～3 000 Da范圍內(nèi),鋼靶板所得的結(jié)果優(yōu)于紙基靶板(圖3A)，鋼靶板分辨率最高為4 309(m/z2 465)，最低為3 155(m/z757)，紙基靶板分辨率最高為4 128(m/z2 465)，最低為2 484(m/z757)；在3 000～20 000 Da范圍內(nèi)，鋼靶板在m/z5 731和m/z12 362的分辨率稍高于紙基靶板，但紙基靶板在m/z8 477和16 952處峰的分辨率優(yōu)于鋼靶板，紙靶板和鋼靶板的最低分辨率同時在m/z8 477處出現(xiàn)，分別為746和413，最高分辨率同時在m/z12 362處出現(xiàn)，分別為1 095和1 501(圖3B)；20 000～60 000 Da范圍內(nèi)，紙基靶板上m/z22 144、33 216和66 430 3個位置峰的分辨率全部都優(yōu)于鋼靶板，且鋼靶板上3個峰分辨率的標(biāo)準偏差平均值要大于紙基靶板，可以看出鋼靶板上峰分辨率的波動比紙基靶板大(圖3C)。導(dǎo)致紙基靶板與鋼靶板對同一樣品分辨率不同的主要原因是同種樣品在不同的靶板上結(jié)晶情況有差異。當(dāng)樣品形成的結(jié)晶小且薄時，樣品離子的初始位置分散減小，縮短了分子量相同的離子到達離子檢測器的時間差，此時可獲得較高的分辨率；但當(dāng)樣品結(jié)晶堆積較厚時，樣品離子的初始位置分散變大，導(dǎo)致分子量相同的離子到達離子檢測器的時間差變大，分辨率變低。但總體上，使用紙基靶板能獲得與鋼靶板差不多的分辨率。

2.3 靈敏度的對比

圖4展示的是10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL的BSA分別在紙基靶板和鋼靶板上的譜圖。當(dāng)樣品濃度為500 fmol/μL時，BSA的3個峰全部清晰可見，說明兩種靶板對于BSA的靈敏度均能達到500 fmol/μL，且紙基靶板上500 fmol/μL BSA在m/z22 144、33 216、66 430位置處峰的信噪比比鋼靶板更高(表1)。這是由于紙基靶板的聚焦效果使得樣品可聚集在小范圍內(nèi)，從而能獲得較高的靈敏度。

2.4 重現(xiàn)性及結(jié)晶均勻性驗證

重現(xiàn)性結(jié)果如圖5所示，在紙基靶板上混合多肽Peptide Calibration StandardI 5個靶點的譜圖均出現(xiàn)了該混合多肽包含的全部離子峰，表明紙基靶板具有較高的重現(xiàn)性，因此紙基靶板的使用不會對質(zhì)譜儀的重現(xiàn)性產(chǎn)生影響。為了進一步驗證樣品與基質(zhì)結(jié)晶在紙基靶板上的均勻性，在激光能量不變的情況下，轟擊ACTH樣品在同一個靶點上的不同位置，每個位置激光以20 Hz的頻率出射80次。圖6即為5個位置的ACTH強度變化，由圖可知ACTH的峰強度依次為438、404、426、479、457 mV，計算得5個數(shù)據(jù)間的變異系數(shù)值僅為6%；在相同條件下，ACTH在鋼靶板上譜圖的峰強度分別為1 105、1 054、846、858、928 mV，變異系數(shù)為12%，表明紙基靶板上的樣品結(jié)晶較鋼靶板更為均勻。

表1 10 pmol/μL、1 pmol/μL、500 fmol/μL牛血清白蛋白信噪比Table 1 S/N ratios of 10 pmol/μL,1 pmol/μL，500 fmol/μL BSA

圖5 紙基靶板5個不同靶點上Peptide Calibration StandardI的譜圖Fig.5 Mass spectra of the five different spots of Peptide Calibration StandardI on paper-based plate

圖6 紙基靶板同一靶點上5個不同位置獲得的ACTH譜圖的峰信號強度Fig.6 Signal intensities of the mass spectra of ACTH in five different shots on paper-based plate

圖7 大腸桿菌在紙基靶板上的譜圖Fig.7 Mass spectra of the Escherichia coli on the paper-based plate

2.5 微生物檢測及質(zhì)量精度驗證

圖7為大腸桿菌提取蛋白在紙基靶板上的譜圖，將譜圖中的主要峰與Jones等[25]在文章中所提的大腸桿菌主要峰的理論峰值相比較，結(jié)果如表2所示。除了m/z9 537.9位置處的峰與理論峰值m/z9 535.3偏差為0.3‰外，其余峰值與理論峰值相差均在0.1‰以下。布魯克MALDI Biotyper細菌鑒定平臺的性能指標(biāo)規(guī)定質(zhì)量精度(外標(biāo)法)在0.5‰以下即可。分析m/z9 535.3位置處偏差較大的可能原因是：在高質(zhì)量范圍內(nèi)，受分辨率的限制，質(zhì)譜儀不能將準分子離子峰與其同位素離子峰完全分開，導(dǎo)致準分子離子峰不是一個呈正態(tài)分布的曲線，因此無法確定準分子離子峰的具體質(zhì)荷比。為解決這一問題需利用軟件在原始離子峰的基礎(chǔ)上擬合出一個正態(tài)分布的曲線，再取其頂點位置的橫坐標(biāo)為峰的質(zhì)荷比。而當(dāng)準分子離子峰強度低于同位素離子峰，且強度最大的同位素離子峰處在準分子離子峰偏右的位置時，就會使擬合的平滑曲線頂點向右偏，導(dǎo)致峰的質(zhì)荷比變大。

表2 紙基靶板上大腸桿菌理論出峰情況與實際出峰情況對比Table 2 Comparison of the theoretical and practical peaks of the Escherichia coli

將質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MicroID微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定分值9.2分，結(jié)果為大腸桿菌(9分以上表示高度可信，8分以上表示結(jié)果可信，6～8分表示結(jié)果可參考，6分以下表示無鑒定結(jié)果或結(jié)果不可信)。初步表明紙基靶板可用于微生物的鑒定。

3 結(jié) 論

本研究提出了一種用于MALDI-TOF MS分析的新型一次性紙基靶板。該靶板相較于普通鋼靶板具有成本低，制作工藝簡單，能有效避免樣品交叉污染，使用后便于處理，減少環(huán)境污染等特點。通過在分辨率、靈敏度、重現(xiàn)性等方面與傳統(tǒng)鋼靶板進行比較，發(fā)現(xiàn)在整體性能上紙基靶板與鋼靶板分辨率相當(dāng)，靈敏度可達到500 fmol/μL(BSA)，且樣品檢測具有較高的重現(xiàn)性。最后利用紙基靶板以及微生物鑒定系統(tǒng)對大腸桿菌進行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)紙基靶板所得的譜圖與實際大腸桿菌出峰情況基本一致且鑒定結(jié)果為高度可信。目前，紙基靶板還在初步測試階段，后續(xù)經(jīng)過進一步的工藝改進有望在臨床微生物的快速診斷等方面發(fā)揮積極的作用。