張變強(qiáng)，唐巧巧，柯靈超，張 健，王德培，朱 燕，高 強(qiáng)

(1. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 天津科技大學(xué)后勤管理處，天津 300457)

肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)是目前葡萄球菌屬中被完全確認(rèn)的一株食品級(generally recognized as safe，GRAS)菌株[1]．肉葡萄球菌作為肉制品發(fā)酵行業(yè)中形成肉制產(chǎn)品獨(dú)特風(fēng)味的關(guān)鍵性菌種，很早就在歐洲尤其是德國，用于制造干火腿與干香腸的初始發(fā)酵劑[2]．此外，與其他革蘭氏陽性細(xì)菌如芽胞桿菌(Bacillus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等相比，肉葡萄球菌具有生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、無外毒素、胞外蛋白酶水解活性低且能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌至培養(yǎng)基中[2-3]的特點(diǎn)，使其不僅可以在代謝工程方面用來研究肉葡萄球菌及相關(guān)屬種的代謝途徑，而且還可以用于外源蛋白的表達(dá)和分泌研究．

然而，作為革蘭氏陽性細(xì)菌，肉葡萄球菌的細(xì)胞壁較厚且致密，感受態(tài)細(xì)胞接收外源載體困難，常規(guī)的熱激轉(zhuǎn)化法幾乎無法使外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞．目前，肉葡萄球菌的外源 DNA轉(zhuǎn)化方法主要有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法和電轉(zhuǎn)化方法．原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法操作復(fù)雜、花費(fèi)時(shí)間較長且轉(zhuǎn)化效率較低，而電轉(zhuǎn)化法操作簡便、理論轉(zhuǎn)化效率高，因而得到廣泛的應(yīng)用[4]．電轉(zhuǎn)化法的原理是使用瞬時(shí)電壓使得細(xì)胞膜被極化而產(chǎn)生瞬時(shí)孔洞，使 DNA等外源物質(zhì)快速進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[5]．電場強(qiáng)度和脈沖持續(xù)時(shí)間在一定范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞的瞬時(shí)通透性是可逆的．隨著電場強(qiáng)度的增加，細(xì)胞膜通透性越高，產(chǎn)生的疏水孔洞也越多，外源 DNA越容易進(jìn)入到細(xì)胞，但隨著電場強(qiáng)度的不斷增加，細(xì)胞的死亡率也會(huì)急劇增加[6]．所以，在電轉(zhuǎn)化過程中需要平衡轉(zhuǎn)化效率和死亡率的關(guān)系，既要提高電場強(qiáng)度，提高轉(zhuǎn)化效率，又要盡可能降低細(xì)胞死亡率．如果在電轉(zhuǎn)化過程中添加合適的高滲溶液給予細(xì)胞一定的保護(hù)，可以提高細(xì)胞的存活率，進(jìn)而提高細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化效率．Loefblom 等[5]建立了S.carnosus TM300的電轉(zhuǎn)化方法，但是操作繁瑣，轉(zhuǎn)化不夠穩(wěn)定，并且未做高滲溶液方面的研究．因此，亟待建立一個(gè)更為穩(wěn)定高效的適合 S.carnosus的電轉(zhuǎn)化方法．

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是在野生型 GFP的基礎(chǔ)上，采用定點(diǎn)突變技術(shù)將Ser65和Phe64分別用Thr和Leu替代而成，通過改造大大增強(qiáng)了熒光亮度和穩(wěn)定性，因此比GFP更適用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究[7]．

本研究在前期研究[8-9]的基礎(chǔ)上，首先優(yōu)化細(xì)菌生長狀態(tài)、電壓、質(zhì)粒質(zhì)量濃度，初步確定較優(yōu)條件，繼而對電擊緩沖液、復(fù)蘇培養(yǎng)基組分、復(fù)蘇培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以期提高肉葡萄球菌的轉(zhuǎn)化效率，為后續(xù)的研究奠定電轉(zhuǎn)化方法學(xué)的基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)TM300、pBT2質(zhì)粒(氯霉素抗性(Cmr)與氨芐青霉素抗性(Ampr))，由德國圖賓根大學(xué)微生物遺傳學(xué)研究所Friedrich Goetz教授饋贈(zèng)；E.coli-Staphylococci穿梭質(zhì)粒pBT2-ET-4C-5R-EGFP，由S.carnosus TM300雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)(Twin arginine translocation，Tat)信號肽與EGFP組成的融合蛋白，本實(shí)驗(yàn)室以pBT2質(zhì)粒為骨架構(gòu)建，具體的構(gòu)建過程參考中國發(fā)明專利申請：一種肉葡萄球菌的電轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用(申請?zhí)枺?01710958394.5，中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局)．

1.1.2 培養(yǎng)基和緩沖液

LB 培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min；固體培養(yǎng)基需添加瓊脂粉20．

B2培養(yǎng)基(g/L)：水解酪蛋白 10，酵母提取物25，葡萄糖 5，NaCl 25，K2HPO41，去離子水配制，pH 7.5，0.67×105Pa滅菌 15min．

LBC 復(fù)蘇培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.5mol/L 蔗糖，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

LBS復(fù)蘇培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.5mol/L 山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

LBM 復(fù)蘇培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，0.3mol/L 甘露醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

TSB 固體培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白 17，大豆蛋白胨3，葡萄糖 2.5，NaCl 5，K2HPO42.5，pH 7.5，瓊脂粉20，去離子水配制，0.67×105Pa滅菌15min．

Glc電擊緩沖液：10%甘油，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌 20min．

GM 電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L甘露醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GS電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GSM 電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L甘露醇，0.5mol/L山梨醇，去離子水配制，pH 7.5，1×105Pa滅菌20min．

GC電擊緩沖液：10%甘油，0.5mol/L蔗糖，去離子水配制，pH 7.5，0.67×105Pa滅菌20min．

12%分離膠(15mL)：ddH2O 4.9mL，Tris-HCl(1.5mol/L，pH 8.8)3.8mL，30%丙烯酰胺6.0mL，10% SDS 0.15mL，10%過硫酸銨 0.15mL，TEMED 6μL．

5%濃縮膠緩沖液(5mL)：ddH2O 3.4mL，Tris-HCl(1.0mol/L，pH 6.8)0.63mL，30%丙烯酰胺0.83mL，10% SDS 0.05mL，10%過硫酸銨0.05mL，TEMED 5μL．

1.1.3 主要儀器設(shè)備

BTX ECM399型指數(shù)衰減波電穿孔系統(tǒng)電轉(zhuǎn)化儀、BTX 610型電轉(zhuǎn)杯(間距 2mm)，美國 BTX 公司；核酸定量儀，德國 IMPLEN公司；ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；DYY-4C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYCZ-40E型半干轉(zhuǎn)膜儀，北京六一儀器廠．

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取與定量檢測

使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的DP103質(zhì)粒小提試劑盒提取 E.coli DH5α/pBT2-ET-4C-5R-EGFP質(zhì)粒，并在電轉(zhuǎn)化S.carnosus TM300之前使用核酸定量儀測定質(zhì)粒濃度．

1.2.2 S.carnosus TM300感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取S.carnosus TM300單菌落接種到裝有5mL LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、180r/min培養(yǎng) 12～16h．將過夜培養(yǎng)的S.carnosus TM300菌液按照1%的接種比例接種在裝有 50mL B2培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，37℃、180r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期(A578=0.6)時(shí)停止培養(yǎng)．將含有菌液的三角瓶冰浴 15min，分裝于 50mL預(yù)冷過的離心管中，4℃、5000r/min離心10min，棄去上清液．分別用40mL與20mL冰冷的 GS電擊緩沖液充分懸浮菌體，4℃、5000r/min離心 10min，棄去上清液，接著用 10mL冰冷的 GS電擊緩沖液洗滌菌體3次．最后用800μL冰冷的GS電擊緩沖液重懸，分裝于1.5mL滅菌離心管中，每管100μL，-80℃保存．

1.2.3 電轉(zhuǎn)化

將 S.carnosus TM300感受態(tài)細(xì)胞從-80℃取出，冰上解凍 5min．在解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中加入500ng質(zhì)粒充分混勻，將全部液體轉(zhuǎn)移到2mm電極間距的電轉(zhuǎn)杯中，置于冰上作用30min后，使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電擊電壓為2450V，電擊后顯示的脈沖時(shí)間為 6ms．電擊后迅速將 1mL LBM 復(fù)蘇培養(yǎng)基加到電轉(zhuǎn)杯中，將全部液體轉(zhuǎn)到1.5mL離心管中，37℃、180r/min搖床復(fù)蘇培養(yǎng)4h．吸取100μL培養(yǎng)液涂布于含終質(zhì)量濃度為10μg/mL Cmr的TSB培養(yǎng)基平板，37℃過夜培養(yǎng)，直至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子并按照式(1)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率．

1.2.4 引物合成

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，設(shè)計(jì)引物 egfp-F/egfp-R擴(kuò)增目的基因 egfp．引物序列為 egfp-F：5'-ATTTGTCCT ACTCAGGAGAGCGTTC-3'，egfp-R：5'-GAGTTGCT AGTAACATCTGACCGA-3'．

1.2.5 轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

為了驗(yàn)證電轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)選擇5個(gè)轉(zhuǎn)化子，用含有10μg/mL Cmr的液體LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)．收集菌體細(xì)胞，提取質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為模板，egfp-F/egfp-R為上、下游引物通過 PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因egfp，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[9]．

1.2.6 EGFP的表達(dá)

分別接種陽性轉(zhuǎn)化菌株 S.carnosus TM300/pBT2-ET-4C-5R-EGFP和陰性對照菌株 S.carnosus TM300于 5mL LB培養(yǎng)液中，37℃、180r/min過夜培養(yǎng)，然后按 1%的接種量將過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至50mL LB培養(yǎng)液中，37℃、180r/min繼續(xù)培養(yǎng)16h，以表達(dá)EGFP．

1.2.7 目的蛋白EGFP的檢測

熒光顯微鏡觀察：取5μL按1.2.6節(jié)方法培養(yǎng)的菌液，滴在載玻片表面并蓋好蓋玻片，置于熒光顯微鏡下觀察菌液的熒光產(chǎn)生情況．

分別提取陽性轉(zhuǎn)化菌株與陰性對照菌株發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，使用5%的濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測及免疫印跡(Western blot)測定．

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長時(shí)期對轉(zhuǎn)化效率的影響

為了研究S.carnosus TM300的不同生長時(shí)期對感受態(tài)細(xì)胞的制備和后續(xù)電轉(zhuǎn)化的影響，在培養(yǎng)細(xì)胞的 A578值分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 時(shí)停止培養(yǎng)并收集菌體，按照1.2.2節(jié)中的S.carnosus TM300感受態(tài)制備方法，獲得不同生長時(shí)期的感受態(tài)細(xì)胞(圖 1)．

圖1 S. carnosus TM300的生長曲線Fig. 1 Growth curve of S. carnosus TM300

將穿梭載體 pBT2-ET-4C-5R-EGFP用電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇培養(yǎng)后涂布于含有10μg/mL氯霉素的 TSB固體培養(yǎng)基平板，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子菌落并計(jì)算轉(zhuǎn)化效率(圖 2)，其中電擊緩沖液為GSM，復(fù)蘇培養(yǎng)基為 LB液體培養(yǎng)基．當(dāng) A578=0.6時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，為 0.53×103μg-1．結(jié)合圖 1可知，此時(shí)菌體處于指數(shù)生長的中前期階段，細(xì)胞生長比較旺盛，電轉(zhuǎn)化效率最佳．

圖2 菌體生長A578值對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 2 Effect of A578 density on the electroporation efficiency

2.2 不同電擊電壓對轉(zhuǎn)化效率的影響

在 A578=0.6時(shí)收集 S.carnosus TM300菌體用于制備感受態(tài)細(xì)胞．在電轉(zhuǎn)化步驟中，先將300ng穿梭載體加入感受態(tài)細(xì)胞，充分混勻后，分別在 1500、1750、2000、2250、2300、2400、2450、2500V 的電壓條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化．電擊完成后向電轉(zhuǎn)杯中加入1mL LB復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃、180r/min復(fù)蘇培養(yǎng)3～4h后涂布于含有10μg/mL氯霉素的TSB固體培養(yǎng)基平板，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子菌落，并計(jì)算不同電壓對應(yīng)的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如圖3所示．

圖3 電壓對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 3 Effect of voltage on the electroporation efficiency

由圖3可知：電壓在2450V時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，為 0.67×103μg-1；2500V 時(shí)的轉(zhuǎn)化效率略低于2450V時(shí)的轉(zhuǎn)化效率；而電壓為 1500V與 1750V時(shí)，轉(zhuǎn)化效率偏低．因此，S.carnosus TM300最適電轉(zhuǎn)化電壓為2450V左右，且電壓宜高不宜低．

2.3 質(zhì)粒質(zhì)量濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

為了研究質(zhì)粒質(zhì)量濃度對S.carnosus TM300電轉(zhuǎn)化效率的影響，本研究選用經(jīng)過上述優(yōu)化的感受態(tài)細(xì)胞，分別取 10、50、100、500、1000、2000ng 穿梭質(zhì)粒加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，在2450V電壓下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化．由圖4可知：在10～100ng/100μL的質(zhì)粒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率較低；在 500ng/100μL時(shí)達(dá)到最高，為1.01×103μg-1；但是在質(zhì)粒質(zhì)量濃度不斷升高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而呈下降趨勢；當(dāng)加入2000ng/100μL質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)化效率下降至 0.046×103μg-1．

圖4 質(zhì)粒質(zhì)量濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 4 Effect of plasmid DNA concentration on the electroporation efficiency

2.4 電擊緩沖液對轉(zhuǎn)化效率的影響

在 A578=0.6時(shí)收集 S.carnosus TM300菌體制備感受態(tài)細(xì)胞．制備感受態(tài)時(shí)用不同的電擊緩沖液(Glc電擊緩沖液、GM電擊緩沖液、GS電擊緩沖液、GSM 電擊緩沖液、GC電擊緩沖液)洗滌細(xì)胞，其余實(shí)驗(yàn)條件與優(yōu)化前相同．由圖 5可知，用 GS電擊緩沖液制備的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率最高，轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 3.89×103μg-1．

圖5 電擊緩沖液對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 5 Effect of electroporation medium on the electroporation efficiency

由圖 5結(jié)果分析：將甘油作為電擊緩沖液使用時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較低，當(dāng)在電擊緩沖液中加入 0.5mol/L的甘露醇或者山梨醇時(shí)，轉(zhuǎn)化效率大幅度提高；當(dāng)山梨醇、甘露醇以等物質(zhì)的量加入時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而下降，因此，確定電擊緩沖液的最佳組成成分為 10%甘油與0.5mol/L山梨醇．

2.5 復(fù)蘇培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化效率的影響

夏子芳等[11]對乳桿菌的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在電擊以后由于受到電壓的創(chuàng)傷很容易死亡，如果此時(shí)在復(fù)蘇培養(yǎng)基中加入合適的高滲溶液，可以有效保護(hù)細(xì)胞，從而提高細(xì)胞的存活率，最終提高電轉(zhuǎn)化效率．在 S.carnosus TM300菌體生長到A578=0.6時(shí)，收集菌體制備感受態(tài)，在電轉(zhuǎn)化步驟加入 500ng穿梭載體進(jìn)行電轉(zhuǎn)化．電擊后立即加入1mL含0.5mol/L不同高滲溶液(蔗糖、甘露醇、山梨醇)的復(fù)蘇培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)后涂布于含有 10μg/mL氯霉素的 TSB固體培養(yǎng)基平板，37℃過夜培養(yǎng)后計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化子菌落，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率．由圖 6可知，電擊后加入含 0.5mol/L甘露醇的復(fù)蘇培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到 4.84×103μg-1．

圖6 復(fù)蘇培養(yǎng)基對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 6 Effect of different osmotic stabilizers in recovery media on the electroporation efficiency

隨后為了研究不同濃度的甘露醇對轉(zhuǎn)化效率的影響，在 LB復(fù)蘇培養(yǎng)基中分別加入 0.1、0.3、0.5mol/L甘露醇，涂板后觀察結(jié)果(圖7)．

圖7 復(fù)蘇培養(yǎng)基中甘露醇濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 7 Effect of mannitol concentrations in recovery media on the electroporation efficiency

由圖 7可知，當(dāng)復(fù)蘇培養(yǎng)基中含有 0.3mol/L甘露醇時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到 5.70×103μg-1．由此得出，在復(fù)蘇培養(yǎng)基中加入0.3mol/L甘露醇時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高；甘露醇的濃度過高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率呈下降趨勢.

2.6 復(fù)蘇時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

本研究選用經(jīng)過上述優(yōu)化的感受態(tài)細(xì)胞，加入500ng/100μL 質(zhì)粒電擊后，分別孵育 1、2、3、4、5、6h，然后涂布于含有10μg/mL Cmr的TSB固體培養(yǎng)基平板，轉(zhuǎn)化效率結(jié)果如圖8所示．

圖8 復(fù)蘇時(shí)間對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig. 8 Effect of incubation time on the electroporation efficiency

由圖 8可知：細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間達(dá)到 4h時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較好，達(dá)到 5.95×103μg-1；4h以后轉(zhuǎn)化效率增加不明顯，所以綜合考慮選擇4h為細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)間．

2.7 肉葡萄球菌轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證電轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化子是否為陽性轉(zhuǎn)化子，本研究隨機(jī)挑取 5個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，egfp-F/egfp-R為上、下游引物，進(jìn)行 PCR驗(yàn)證．PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，結(jié)果如圖9所示．

pBT2-ET-4C-5R-EGFP作為陽性對照，對各轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒的 PCR驗(yàn)證均在 1440bp左右出現(xiàn)目的條帶，且與陽性對照結(jié)果一致，證明質(zhì)粒 pBT2-ET-4C-5R-EGFP成功地轉(zhuǎn)化到S.carnosus TM300宿主中．

2.8 熒光顯微鏡觀察

使用NIKON ECLIPSE TE2000-U型熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)化子菌液，結(jié)果如圖 10所示．與圖 10(a)的S. carnosus TM300陰性對照對比觀察可知，圖10(b)中構(gòu)建成功的S. carnosus TM300轉(zhuǎn)化株發(fā)出綠色熒光，說明載體pBT2-ET-4C-5R-EGFP編碼的EGFP蛋白能夠以活性形式得到表達(dá)．

圖10 EGFP熒光顯微鏡觀察Fig. 10 Fluorescence observation of EGFP expression

2.9 SDS-PAGE與Western blot分析

分別提取S.carnosus TM300及轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液中的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot蛋白免疫印跡．如圖 11和圖 12所示，野生型菌株S. carnosus TM300作為陰性對照，其發(fā)酵液中沒有出現(xiàn)目的條帶，而轉(zhuǎn)化菌株均在 5.4×104左右處有目的條帶．表明肉葡萄球菌轉(zhuǎn)化株成功地將表達(dá)的EGFP以二聚體形式分泌至細(xì)胞外的發(fā)酵液環(huán)境中．

3 討 論

電轉(zhuǎn)化法作為一種高效的轉(zhuǎn)化方法，目前廣泛應(yīng)用于外源基因轉(zhuǎn)染等多個(gè)領(lǐng)域[10]．但在實(shí)際操作過程中，電轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率受到諸多因素的影響，包括細(xì)菌生長狀態(tài)、生長培養(yǎng)基組分、電擊緩沖液組分、電擊電壓、脈沖時(shí)間、電場強(qiáng)度、電阻、質(zhì)粒 DNA 濃度、復(fù)蘇培養(yǎng)基組分[11]、復(fù)蘇時(shí)間[12]等多個(gè)方面．為了提高電轉(zhuǎn)化效率，不同菌株和質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化都需要對電轉(zhuǎn)化條件作出調(diào)整和優(yōu)化．

本研究對影響S.carnosus TM300電轉(zhuǎn)化效率的有關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，S.carnosus TM300在 A578=0.6時(shí)有最高的轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到 0.53×103μg-1．另外，對影響電轉(zhuǎn)化的電壓和質(zhì)粒質(zhì)量濃度因素進(jìn)行了優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)，在電壓為2450V時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到0.67×103μg-1．電壓過低或過高都會(huì)對電轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生顯著的影響，其原因可能是電壓過低時(shí)細(xì)胞表面的動(dòng)作電位處于不應(yīng)期的時(shí)間較長[13]，細(xì)胞無法產(chǎn)生孔隙，外源 DNA 從而無法進(jìn)入細(xì)胞；電壓過高時(shí)，細(xì)胞在瞬時(shí)高壓下產(chǎn)生不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡．同時(shí)，質(zhì)粒質(zhì)量濃度對電轉(zhuǎn)化效率的影響也較大．在本研究中，質(zhì)粒質(zhì)量濃度為500 ng/100μL時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到 1.01×103μg-1．質(zhì)粒質(zhì)量濃度過高或過低都會(huì)導(dǎo)致電轉(zhuǎn)化效率降低，出現(xiàn)這種情況的原因可能是質(zhì)粒 DNA濃度過低時(shí)，DNA分子數(shù)量太少，細(xì)胞未得到充分利用，轉(zhuǎn)化效率偏低；而當(dāng)質(zhì)粒質(zhì)量濃度過高時(shí)，細(xì)胞所能夠吸收的 DNA分子達(dá)到過飽和的狀態(tài)，反而不利于轉(zhuǎn)化，肖沖等[14]在乳酸菌電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究中也證實(shí)了這一點(diǎn)．研究還發(fā)現(xiàn)，洗滌緩沖液對感受態(tài)細(xì)胞的制備影響較大，用山梨醇、甘露醇、蔗糖等高滲劑配成高滲溶液洗滌菌體細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化效率有顯著提高．其原因可能是一方面高滲溶液能夠降低細(xì)胞表面的離子強(qiáng)度，另一方面能夠給細(xì)胞提供一個(gè)高于細(xì)胞質(zhì)滲透壓的環(huán)境而促進(jìn)細(xì)胞收縮，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞膜的再密封能力，降低胞內(nèi)物質(zhì)的流出速度，最終提高細(xì)胞的存活率[15]．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用 10%甘油與0.3mol/L甘露醇配成的高滲溶液洗滌菌體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效果最好，轉(zhuǎn)化效率提高至 3.89×103μg-1．此外，電擊后在復(fù)蘇培養(yǎng)基中加入山梨醇、甘露醇等滲透壓保護(hù)劑時(shí)，對 S.carnosus TM300的轉(zhuǎn)化效率也有顯著的提高，當(dāng)加入的甘露醇為0.3mol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 5.70×103μg-1，這與 Xue等[16]對枯草芽胞桿菌電轉(zhuǎn)化的研究結(jié)果相類似．另外，電擊后的復(fù)蘇時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率也具有顯著的影響，當(dāng)復(fù)蘇時(shí)間為 4h時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率較好，達(dá)到 5.95×103μg-1．復(fù)蘇時(shí)間之所以對轉(zhuǎn)化效率有影響，原因可能是電擊后細(xì)胞表面會(huì)產(chǎn)生孔隙，而要閉合孔隙，需要將細(xì)胞置于含有特定高滲溶液的復(fù)蘇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，使細(xì)胞孔隙閉合復(fù)原，從而有助于提高細(xì)胞的存活率，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化效率[17]．對經(jīng)過上述優(yōu)化得到的轉(zhuǎn)化株檢測發(fā)現(xiàn)，EGFP蛋白在 S.carnosus TM300中成功表達(dá)，并能夠以二聚體形式轉(zhuǎn)運(yùn)至發(fā)酵液中．這可能是聚合界面的疏水性氨基酸殘基較多[18]，導(dǎo)致 EGFP蛋白聚合所致．

綜上所述，通過優(yōu)化以上電轉(zhuǎn)化參數(shù)，S.carnosus TM300的電轉(zhuǎn)化效率達(dá)到 5.95×103μg-1，比高強(qiáng)等[7]以前報(bào)道的轉(zhuǎn)化效率提高了 5倍，且目的蛋白EGFP成功分泌至發(fā)酵液中．優(yōu)化后的電轉(zhuǎn)化方法可以用于肉葡萄球菌的基因高效轉(zhuǎn)化，為今后肉葡萄球菌的基因工程改造以及合成生物學(xué)等研究奠定了有力的電轉(zhuǎn)化方法學(xué)基礎(chǔ)．