張雅馨，蘇杰，黃帥，張新躍，劉穎，王林洪

作者單位：華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山 063000

近年來，由多種缺血性眼病所引發(fā)的視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI)病例逐年增多，嚴重危害著病人的健康。視網(wǎng)膜是眼球后部的一層薄膜，可以看作是大腦的一部分，主要是由叢狀層和神經(jīng)纖維層構(gòu)成的白質(zhì)、光感受器和神經(jīng)節(jié)細胞構(gòu)成的灰質(zhì)和Müller細胞及小星型細胞構(gòu)成的神經(jīng)膠質(zhì)組成，對缺血缺氧環(huán)境極為敏感，且易受損傷，而且主要供給視網(wǎng)膜血供的終末動脈—視網(wǎng)膜中央動脈極易發(fā)生阻塞、缺血，一旦發(fā)生便可極快地損傷視網(wǎng)膜。RIRI是臨床常見疾病，即缺血性眼病病人視網(wǎng)膜在恢復(fù)供血后，視功能不升反降，主要發(fā)生于糖尿病、視網(wǎng)膜中央靜動脈阻塞、缺血性病變、青光眼等疾病中，其視神經(jīng)損害主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)的凋亡[1]，隋源等[2]研究指出，RIRI中神經(jīng)元的丟失也主要集中體現(xiàn)在RGCs。因此，視網(wǎng)膜缺血性疾病的預(yù)防及早期治療極為重要。已有研究表明，丁苯酞對于腦缺血再灌注損傷中神經(jīng)功能損傷具有很強的保護作用[3]，筆者自2016年11月至2017年1月就丁苯酞對RIRI中細胞凋亡的作用進行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物健康雄性新西蘭白兔80只，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，外眼及眼底檢查均正常，飼養(yǎng)環(huán)境相同，均由華北理工大學(xué)動物實驗中心提供。實驗中充分保證動物福利、給予動物人道關(guān)懷，動物處置也符合倫理學(xué)原則。

1.2 主要試劑丁苯酞(恩必普，石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；封閉用正常山羊血清工作液SP-9001(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；抗P53多克隆抗體、抗Bcl-2多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊超敏二步法檢測試劑盒(二抗)(北京中杉)等。

1.3 模型制備采用前房高眼壓灌注法[4]制備缺血再灌注模型。術(shù)前給予丙美卡因點眼，復(fù)方托吡卡胺點眼至瞳孔完全散大后固定白兔，25%烏拉坦耳緣靜脈麻醉，劑量4 mL/kg。麻醉成功后，白兔取仰臥位，將4.5號頭皮針(連接250 mL 0.9%鹽水袋)刺入前房，鹽水袋垂直于兔眼，高度150 cm，此時眼底鏡可見視網(wǎng)膜缺血水腫、蒼白，持續(xù)1 h。對照組不予任何處理。氯霉素全程間斷點眼保持角膜濕潤，預(yù)防感染。

1.4 分組與給藥采用隨機數(shù)字表法將實驗動物分成對照組(10只)、RIRI組(35只)、給藥組(35只)三組，其中對照組再分為6 h、24 h兩個亞組(排除時間和環(huán)境因素)，RIRI組和給藥組均再分7個亞組，分別為再灌注后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d。排除標準：未到達預(yù)定時間死亡及造模失敗、有嚴重手術(shù)并發(fā)癥的白兔。將丁苯酞軟膠囊用食用麻油稀釋到10 mg/mL。治療組于造模成功后開始灌胃給藥，給藥劑量為40 mg/kg，每日1次，直至處死。對照組和RIRI組每日給予相同體積食用麻油灌胃。

1.5 標本的制備將實驗動物按照規(guī)定時間于耳緣靜脈過量麻醉處死后摘取眼球，快速置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上。將眼球壁自視乳頭處縱行剪開，在平行、垂直于視神經(jīng)平面各取一塊約1 cm×0.5 cm視網(wǎng)膜組織置于包埋盒中，經(jīng)過水洗、脫水、透明、石蠟包埋、切片，分別行HE染色、免疫組化法檢測B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、抑癌基因(P53)表達量及TUNEL檢測細胞凋亡。

1.6 結(jié)果的判讀封片后，每張切片隨機取4個面積為0.2 mm×0.2 mm的高倍鏡視野(400×)觀察組織形態(tài)變化，應(yīng)用計算機輔助圖像分析技術(shù)系統(tǒng)分析，計數(shù)各組陽性細胞數(shù)，計算平均值。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化對照組兔視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)與人相似。RIRI組1 h視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層及內(nèi)叢狀層組織出現(xiàn)輕度水腫，厚度增加，染色較淡；6～24 h三個時間點，組織水腫逐漸加劇，其中神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢狀層最明顯，可見RGCs排列稀疏；24 h視網(wǎng)膜內(nèi)界膜不平滑,全層均可見高度水腫，神經(jīng)纖維層明顯薄變，內(nèi)核層細胞雜亂排列，RGCs數(shù)量大幅減少，細胞變性，邊界不清(圖1)。48 h、72 h各層組織水腫明顯減輕；120 h、7 d，視網(wǎng)膜水腫大幅消退，內(nèi)層明顯萎縮，RGCs數(shù)量減少且稀疏排列。給藥組視網(wǎng)膜缺血再灌注后視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化與RIRI組相比均較后者輕，可見丁苯酞能明顯的減輕缺血再灌注后視網(wǎng)膜組織的損傷。

2.2 Bcl-2和P53蛋白的表達

2.2.1Bcl-2的表達 Bcl-2具有抑制凋亡的作用，其陽性表達為細胞質(zhì)的棕黃色染色。本實驗中對照組檢測到極少陽性染色細胞，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示RIRI可以使Bcl-2表達增加(表1)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時可見極少數(shù)陽性表達；6 h、12 h神經(jīng)節(jié)細胞層陽性表達逐漸增多；24 h陽性表達到達高峰，除神經(jīng)節(jié)細胞層外，內(nèi)核層也可見陽性表達，外核層及色素上皮層未見陽性表達(圖2)；48 h、72 h可見神經(jīng)節(jié)細胞層陽性表達逐漸下降，至7 d時已幾乎無陽性細胞表達。給藥組Bcl-2表達變化趨勢同RIRI組相似，但各個時間點表達強度較RIRI組明顯增強(7 d除外)，同RIRI組各時段相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 RIRI組和對照組Bcl-2在再灌注后6 h、24 h陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米，

表2 RIRI組和給藥組Bcl-2再灌注后各時間段陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米，

注：1.a組內(nèi)1 h與6 h比,P<0.01；2.b組內(nèi)12 h與6 h比,P<0.01；3.c組內(nèi)24 h與12 h比,P<0.01；4.d組內(nèi)48 h與24 h比,P<0.01；5.e組內(nèi)72 h與48 h比,P<0.01；6.f組內(nèi)7 d與72 h比,P<0.01

2.2.2P53的表達 p53能通過下調(diào)Bcl-2基因表達而產(chǎn)生促節(jié)細胞凋亡作用，其陽性表達為細胞核質(zhì)的棕色或淺棕色染色。對照組神經(jīng)節(jié)細胞檢測到極少陽性表達，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示RIRI可以使P53表達增加(表3)。RIRI組在缺血再灌注后1 h時可見極少數(shù)陽性表達；6 h、12 h神經(jīng)節(jié)細胞層可見陽性表達逐漸增多；24 h陽性表達到達高峰，除神經(jīng)節(jié)細胞層外，內(nèi)核層也可見陽性表達，外核層及色素上皮層未見陽性表達(圖3)；48 h、72 h可見神經(jīng)節(jié)細胞層陽性表達逐漸下降，至7 d時陽性細胞表達較少。給藥組P53表達變化趨勢同RIRI組相似,但各時間點表達強度明顯減弱,同RIRI組各時段相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表4)。

2.3 TUNEL法檢測細胞凋亡凋亡陽性細胞表達于細胞核，顏色為棕黃色。對照組可見極少凋亡陽性細胞，兩個時間點無明顯差異，而RIRI組兩時間點與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示RIRI可以使凋亡增加(表5)。RIRI組再灌注后1 h神經(jīng)節(jié)細胞層已經(jīng)出現(xiàn)少量凋亡陽性表達；24 h前陽性表達呈上升趨勢，24 h陽性表達出現(xiàn)峰值(除神經(jīng)節(jié)細胞層外，內(nèi)核層、外核層也可見陽性細胞)(圖4)；48 h、72 h凋亡細胞數(shù)目呈下降趨勢；7 d時可見視網(wǎng)膜凋亡陽性細胞數(shù)極少，細胞核大量丟失。給藥組凋亡細胞表達變化趨勢同RIRI組，但各時間點表達強度明顯減弱(7 d除外)，同RIRI組各時段相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表6)。

表3 RIRI組和對照組P53在再灌注后6 h/24 h陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米，

表4 RIRI組和給藥組P53再灌注后各時間段陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米,

注：a組內(nèi)1 h與6 h比,P<0.01；b組內(nèi)12 h與6 h比,P<0.01；c組內(nèi)24 h與12 h比,P<0.01；d組內(nèi)48 h與24 h比,P<0.01；e組內(nèi)72 h與48 h比,P<0.01；f組內(nèi)7 d與72 h比,P<0.01

表5 RIRI組和對照組在再灌注后6 h、24 h凋亡陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米，

3 討論

丁苯酞化學(xué)名稱為消旋-3-正丁基苯酞(dl-3n-butylphthalide)，是我國近年自主研發(fā)的一類新藥。既往大量的實驗研究及臨床觀察證實了丁苯酞在人體內(nèi)靶點眾多，能廣泛分布于胃、腸、腦、脂肪等器官，直接透過血-腦屏障，能作用于心腦缺血疾病的多個病理環(huán)節(jié)，對腦缺血性疾病、血栓形成、血小板聚集、甚至急性缺血性腦卒中等疾病起到明顯改善作用，不僅能改善線粒體功能，還對腦部缺血區(qū)域的血流量、微循環(huán)、清除自由基和腦部功能代謝均起到改善作用，促進功能恢復(fù)的同時無明顯不良反應(yīng)及毒副作用[5-10]。Xu等[11]實驗研究證實了丁苯酞對腦組織缺血性神經(jīng)損傷有很強的保護作用，可最大程度恢復(fù)神經(jīng)功能。有學(xué)者[12-13]研究丁苯酞對凋亡相關(guān)因子的影響的實驗結(jié)果表明丁苯酞對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其機制可能與上調(diào)Bcl-2的表達、下調(diào)Bax的表達有關(guān)。袁曉勇[14]通過研究家兔體內(nèi)丁苯酞藥動學(xué)發(fā)現(xiàn)其口服給藥吸收迅速，30 min即可達最大血藥濃度，且能迅速消除。雖然口服給藥生物利用度較低，但大量實驗研究表明口服給藥方式在體內(nèi)諸多器官廣泛分布，以腦組織為主要靶器官，能起到有效的抑制細胞凋亡、減輕神經(jīng)損傷的作用。本次實驗也表明了丁苯酞對RCGs的凋亡具有較好的保護作用。

表6 RIRI組和給藥組再灌注后各時間段凋亡陽性細胞數(shù)/(n=5，個/平方毫米，

注：1.a組內(nèi)1 h與6 h比，P<0.01；2.b組內(nèi)12 h與6 h比，P<0.01；3.c組內(nèi)24 h與12 h比，P<0.01；4.d組內(nèi)48 h與24 h比，P<0.01；5.e組內(nèi)72 h與48 h比，P<0.01；6.f組內(nèi)7 d與72 h比，P<0.01

細胞凋亡的發(fā)生由凋亡基因來進行調(diào)控，從一些早期的研究我們可以得知在視網(wǎng)膜缺血再灌注模型中，凋亡細胞存在于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細胞層以及內(nèi)核層[15]。任玉偉和宿華威[16]的實驗研究表明Bcl-2蛋白具有抑制細胞凋亡作用，而P53則作為調(diào)控Bax/Bak的上游調(diào)控機制誘導(dǎo)細胞凋亡[17]。本次實驗通過等劑量的丁苯酞與食用麻油灌胃給藥，可見在缺血再灌注損傷后1～24 h Bcl-2/P53表達均明顯增加，24 h達到高峰，24 h后則表達逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在給藥組中我們可以見到Bcl-2的表達均比同一時間點的RIRI組增強，差異有統(tǒng)計意義(7 d組除外)；P53的表達給藥組均低于同一時間點的RIRI組，差異有統(tǒng)計意義，證明了丁苯酞可以通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)P53的表達起到抑制細胞凋亡的作用。而TUNEL試驗中給藥組各時間點凋亡細胞數(shù)均小于RIRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(7 d組除外)，也同樣證實了丁苯酞對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中細胞凋亡起到了保護作用。本實驗中7 d時凋亡和Bcl-2蛋白的陽性表達的組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能是與在7 d時觀察時間過長，RIRI對視網(wǎng)膜的損傷逐漸減輕及視網(wǎng)膜自身修復(fù)作用逐漸加強有關(guān)。

從本次實驗結(jié)果整體來看可以得出，丁苯酞能上調(diào)Bcl-2和下調(diào)P53的表達，減少凋亡細胞的表達數(shù)目，對RIRI后的細胞凋亡起到了一定的保護作用，提示丁苯酞可以透過血-視網(wǎng)膜屏障。但并未能完全避免凋亡的發(fā)生，可能的原因為一旦凋亡機制啟動，凋亡的發(fā)生可能是無法避免的。本次實驗沒有給予不同濃度的劑量，故不同藥物濃度對RIRI的影響有待進一步深入研究。

(本文圖1～4見插圖7-1)