楊琳琳，王藝芳，葛文超，方建華

(河南省紅十字血液中心檢驗科，河南 鄭州 450012)

《衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》明確提出：要完善無償獻血服務體系，加強血站血液安全保障能力建設，積極推進血站核酸檢測工作，提高血站實驗室檢測能力。為了進一步提高血液質量和保證血液安全，核酸檢測（NAT）技術已在我國采供血機構大力推廣和應用。NAT能大大縮短經(jīng)血液傳播傳染病毒檢測的“窗口期”，降低輸血傳播傳染病毒的風險[1，2]。從2012年5月開始對本血液中心的無償獻血者標本進行NAT檢測，本文通過對鄭州地區(qū)無償獻血者的NAT結果分析，以評估核酸檢測的功效。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2012年5月-2017年12月本中心和集中化七家中心血站采集的無償獻血者標本。獻血者均符合國家《獻血者健康檢查要求》中的相關要求。所有標本的采集、離心、運輸和保存均按《血站技術操作規(guī)程2015版》中相關要求進行操作。

1.2 主要試劑 HBsAg ELISA檢測試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；珠海麗珠試劑股份有限公司），抗-HCV ELISA檢測試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；上?？迫A生物工程股份有限公司），抗-HIV1/2 ELISA檢測試劑盒（北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司；法國BIO-RAD公司）。乙型肝炎丙型肝炎人類免疫缺陷病毒（I型）核酸檢測試劑 （上海科華生物工程股份有限公司），Cobas TaqScreen MPX text和Cobas TaqScreen MPX 2.0 text（美國羅氏診斷公司）；配套耗材均由各試劑公司提供，均在有效期內使用。衛(wèi)計委臨檢中心鑒別確認試驗試劑為羅氏定量二代 （美國羅氏診斷公司），乙肝血清學補充試驗試劑為雅培化學發(fā)光試劑（美國雅培公司）。

1.3 主要儀器 ELISA檢測使用：Hamilton Star全自動加樣儀（瑞士HAMILTON公司）和FAME酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司）。核酸檢測使用：Hamilton Star全自動混樣儀 （瑞士HAMILTON公司），ABI 7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司），Cobas AmpLiPrep核酸提取儀和Cobas Taq-Man Analyzer核酸擴增檢測儀通過混樣和數(shù)據(jù)管理服務器（PDM）連接組成羅氏診斷Cobas's 201血液核酸血篩平臺（簡稱CAP/CTM），低溫大容量離心機KUBOTA 8730（日本KUBOTA公司）。

1.4 檢測方法 ELISA檢測和NAT檢測嚴格按試劑盒說明書進行操作和判定結果[3]。

1.5 NAT陽性標本的確認實驗和血清學補充實驗采用實驗室的另一種NAT試劑NAT陽性標本進行確認，并送衛(wèi)計委臨檢中心做乙肝血清學補充試驗[3]。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NAT檢測結果 對ELISA檢測陰性（酶免雙試劑陽性標本除外）的其中571028例標本進行NAT結果，共檢出346例HBV DNA+、2例HCV RNA+和10例HIV RNA+?？偟腘AT陽性率為0.63‰。見表1。

2.2 NAT陽性標本的再檢結果 40例NAT陽性標本經(jīng)另一種試劑（羅氏二代）確認，27例為NAT陽性，檢出率為67.50%。見表2。

2.3 乙肝血清學補充實驗結果 38例送檢標本乙肝“兩對半”結果的血清學模式：5例單純抗-HBs陽性 （13.16%）；4例乙肝 “兩對半”結果為陰性（10.53%）；29例抗-HBc陽性（76.31%），其中有 1例HBsAg已轉為陽性。見表3。

3 討論

由于病毒抗原、抗體蛋白結構的變異，造成“窗口期”漏檢的存在，常規(guī)的酶免檢測對經(jīng)血傳播傳染疾病的風險不能完全避免[2]。而核酸檢測技術（NAT）敏感性較高，在病毒感染后數(shù)天即能檢出標本中的極微量的病毒核酸，可大大縮短 “窗口期”，發(fā)現(xiàn)隱匿性病毒感染，減少因ELISA漏檢而造成的輸血后病毒感染[3，4]。

在獻血者血液篩查中引入NAT，其主要目的是檢測出原有ELISA可能漏掉的具有感染性的獻血者樣本。從2012年5月到2017年12月采用科華核酸檢測系統(tǒng)共檢測了571028例標本，共檢出346例 HBV DNA+、2例 HCV RNA+和 10例 HIV RNA+?？偟腘AT陽性率為0.63‰和上海0.63‰[5]一致，低于西安 0.66‰[6]、 杭州 2.00‰[7]、 合肥1.62‰[8]、烏魯木齊 1.10‰[9]和南京 0.94‰[10]。 總有效拆分率56.38%也高于實驗室之前報道該試劑的33.33%[3]。除2012年外，不同年份間NAT陽性率和不同年份拆分陽性率之間有差異。2012年沒有NAT陽性標本檢出，2013年和2014年NAT陽性率和拆分陽性率保持在一個比較平穩(wěn)的狀態(tài)，分析可能原因：在開展核酸檢測的第1年，實驗室各方面條件還不夠成熟，工作人員對儀器和試劑的性能不夠了解，操作不夠熟練。隨著標本量的增加以及工作人員的操作逐漸熟練，陽性率相對平穩(wěn)。和2013年和2014年相比，2015年和2016年NAT陽性率和拆分陽性率都有上升，查看實驗記錄后發(fā)現(xiàn)：在2015年上半年只用該系統(tǒng)檢測了兩萬份左右標本，陽性率和拆分陽性率與之前持平，在2015年11月開展了核酸集中化檢測直到2016年底結束。分析原因可能是：7個血站的標本全部送到血液中心集中檢測，檢測前大批量的標本處理，可能會造成一些假陽性；各個單位血液篩查實驗室的酶免檢測HBsAg/抗-HCV/抗-HIV1/2所用試劑、設備和人員操作水平以及地區(qū)流行病學特點也不盡相同，可能在某種程度上提升了NAT陽性率。2017年NAT陽性率下降可能與所檢測無償獻血人群標本HBV、HCV、HIV的感染率有關。40例NAT陽性標本經(jīng)羅氏二代試劑檢測，確認檢出率為67.50%。NAT陽性標本的確認對科華核酸檢測系統(tǒng)的檢出率起到了監(jiān)控作用，本實驗室已開始對確認結果不一致的獻血者進行追蹤隨訪并將其血漿標本送檢第三方實驗室確認。

表1 2012～2016年核酸檢測結果（n=571028）

表2 NAT陽性標本的再檢確認結果（n=40）

表3 NAT陽性標本的乙肝“兩對半”血清學模式（n=38）

目前，鄭州地區(qū)無償獻血者的HBV感染率較高，輸血傳播HBV殘余風險明顯高于HCV和HIV，HBV DNA陽性346例，占96.80%。筆者對38例HBV DNA陽性標本進行了血清學補充實驗發(fā)現(xiàn)：5例單純抗-HBs陽性（13.16%）；4例乙肝“兩對半”結果為陰性（10.53%），這4例可能為“窗口期”感染；29例為抗-HBc陽性（76.31%），其中有1例HBsAg已轉為陽性，其余標本若證實為隱匿性HBV感染（OBI），說明鄭州地區(qū)輸血殘余風險主要來自于OBI。目前，本實驗室已建立了ELISA陰性NAT陽性獻血者追蹤隨訪程序，便于適時監(jiān)測輸血傳染病的血清轉化情況。在追蹤的獻血者中，其中1例HCV RNA陽性的獻血者，在追蹤第6周時獻血者抗-HCV完全轉為陽性[11]。

綜上所述，NAT能從ELISA檢測陰性的無償獻血者標本中檢出漏檢的病毒感染者，降低輸血感染病毒的風險，是ELISA檢測的有力補充。核酸檢測應用于鄭州地區(qū)血液篩查是十分可行且有效地保障了臨床輸血安全。