廖 陳，夏霜莉，李秀芳，代 蓉

（云南中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染（upper respiratory tract infection，URTI）簡稱“上感”，是自鼻腔至咽喉部急性炎癥的總稱，具有易傳染、發(fā)病率高的特點(diǎn)。URTI常在氣候驟變時(shí)易于流行，大部分由流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒和呼吸道合胞病毒等病原體感染引起，感染過程持續(xù)發(fā)展可誘發(fā)支氣管炎、中耳炎、肺炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征和呼吸衰竭[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，呼吸系統(tǒng)疾病仍居于人口死亡率的第4位，且患病率呈逐年上升趨勢[2]。目前，對于URTI的防治，臨床常用解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥進(jìn)行對癥治療，采用流感病毒疫苗接種進(jìn)行預(yù)防，但病毒具有種類多、變異速度快的特點(diǎn)，使疫苗接種難以取得理想效果[3-4]。因此，尋找有效防治URTI的藥物具有重要意義。

銀翹散始載于溫病學(xué)家吳鞠通的《溫病條辨》由金銀花、連翹、桔梗、薄荷等中藥組成，具有辛涼透表、清熱解毒的功效，主治風(fēng)溫初起，頭痛口渴，咳嗽咽痛等。臨床常用于治療呼吸道感染、肺炎、水痘、麻疹、猩紅熱等感染性疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，銀翹散具有抗炎止痛[5]、抑制病毒[6]和調(diào)節(jié)免疫[7]等作用，但其具體機(jī)制仍待探究?；谥兴帍?fù)方具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)治療疾病的特點(diǎn)，可通過借助數(shù)據(jù)挖掘以及靶點(diǎn)預(yù)測等多種手段，從系統(tǒng)的角度剖析藥效物質(zhì)與相關(guān)疾病之間特定節(jié)點(diǎn)的相互作用，多層次、多角度地闡述中藥復(fù)方的整體調(diào)節(jié)作用機(jī)制[8]。本研究將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，通過獲取銀翹散防治URTI的主要活性成分、作用靶點(diǎn)和信號通路，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而深入挖掘銀翹散治療URTI的可能作用機(jī)制，并為臨床應(yīng)用銀翹散防治URTI提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 獲取銀翹散化學(xué)成分及篩選活性成分 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[9]（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）檢索銀翹散中金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子等多味中藥所含的化學(xué)成分，對所有成分進(jìn)行初步篩選，依據(jù) 藥 物 ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）特性，以口服生物利用度（oral bioactivity，OB）和藥物相似性（drug-likeness，DL）作為篩選指標(biāo)，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，確定符合條件的活性成分。

1.2 預(yù)測銀翹散潛在靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，將銀翹散中的活性成分與相應(yīng)靶點(diǎn)逐一匹配，運(yùn)用U－niprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）[10]和 PubMed數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）查詢與靶點(diǎn)蛋白相應(yīng)的官方基因名，物種限定為“Homo sapiens”，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 獲取URTI疾病相關(guān)靶點(diǎn) 以“upper respiratory tract infection”為關(guān)鍵詞，在 Online Mendelian Inheritance In Man（OMIM）（http：//www.omim.org/）[11]數(shù)據(jù)庫和 GeneCards（https：//www.genecards.org/）[12]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，獲取上呼吸道感染的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 利用Venn在線平臺(tái)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制“藥物-疾病”韋恩圖，獲取藥物和疾病共有靶點(diǎn)。將銀翹散的活性成分與相應(yīng)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件[13]中，構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，得到銀翹散成分和上感疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖?；诠?jié)點(diǎn)、邊、關(guān)聯(lián)性設(shè)置不同顏色，節(jié)點(diǎn)（node）表示活性成分和作用靶點(diǎn)，邊（edge）表示2個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的相互作用。

1.5 構(gòu)建蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖 將銀翹散和URTI的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING在線平臺(tái)（http：//string-db.org）[14]，種屬選擇為“Homo sapiens”，置信區(qū)間設(shè)置為大于0.7，保存相應(yīng)文本分析結(jié)果并導(dǎo)入Cytoscape，實(shí)現(xiàn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.6 生物學(xué)過程與通路富集分析 為了分析銀翹散治療URTI的生物學(xué)過程和細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)過程，繼而進(jìn)一步闡明銀翹散的作用機(jī)制，將銀翹散治療URTI的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/）[15]，物種限定為“Homo sapiens”，設(shè)定 P＜0.01，進(jìn)行生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedoa of Genes and Genomes，KEGG） 富集分析[16]，并選取排名前15的分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 銀翹散中有效活性成分及潛在靶點(diǎn)的收集與篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取銀翹散所含的化學(xué)成分，設(shè)置OB≥30%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，以確定金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、甘草、荊芥穗、淡豆豉、桔梗和蘆根分別含有 23、23、10、2、92、8、2、7 和 1 個(gè)有效活性成分。主要活性成分包括了連翹脂（（-）-phillygenin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaemferol）、連翹醇（forsythinol）、6-羥基黃酮（6-monohydroxyflavone）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、豆甾醇（stigmasterol）等。由于不同中藥可能存在相同活性成分和共同靶點(diǎn)，祛除重復(fù)值后，銀翹散全方共獲得150個(gè)有效化學(xué)成分和162個(gè)潛在靶點(diǎn)，舉例OB值排名前十的化合物（表1）。

2.2 URTI疾病靶點(diǎn)篩選 以“upper respiratory tract infection”為關(guān)鍵詞，通過OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索獲得154個(gè)和4 988個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，祛除重復(fù)值后，共獲得5 103個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 通過上述在線數(shù)據(jù)庫的篩選，獲取銀翹散的藥物作用靶點(diǎn)共162個(gè)，URTI的疾病相關(guān)靶點(diǎn)共5 103個(gè)，繼而取其交集部分靶點(diǎn)，明確“藥物-疾病”共同靶點(diǎn)117個(gè)，即藥物作用于疾病的潛在作用靶基因。將銀翹散150個(gè)活性成分及117個(gè)“藥物-疾病”共同靶點(diǎn)的對應(yīng)文本信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1），共有336個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 758條邊，其中不同顏色三角形代表不同中藥所含成分，藍(lán)色長方形代表成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。

表1 銀翹散中OB值排名前10的化合物基本信息

圖1 “成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 基于STRING數(shù)據(jù)庫，將117個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以文本形式導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中以實(shí)現(xiàn)可視化，節(jié)點(diǎn)大小代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度（圖2）。由圖可見，銀翹散活性成分主要作用于白介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤蛋白 P53（tumor protein P53，TP53）、絲裂原活化蛋白激酶 1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、淀粉樣蛋白（amyloid beta precursor protein，APP）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等靶基因，提示銀翹散的活性成分可通過同時(shí)作用于多個(gè)靶點(diǎn)來影響和干預(yù)疾病的發(fā)展進(jìn)程。

圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

表2 靶基因GO富集分析

2.5 生物學(xué)過程和通路富集分析 對銀翹散治療URTI的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以P＜0.01為篩選指標(biāo)，富集出顯著生物學(xué)過程和通路。GO富集分析包括了生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）3個(gè)部分。BP主要富集在外部刺激及小分子代謝過程的調(diào)節(jié)，主要涉及藥物、缺氧、有毒物質(zhì)相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)，炎癥反應(yīng)，信號傳導(dǎo)，細(xì)胞的增殖遷移和凋亡等；CC主要涉及在細(xì)胞外空間、質(zhì)膜、細(xì)胞表面、受體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)等；MF主要涉及酶結(jié)合、絲氨酸性內(nèi)肽酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合和蛋白酶結(jié)合等（表2）。KEGG分析結(jié)果顯示銀翹散治療URTI共涉及121條通路，選取前15條相關(guān)通路（表3），主要涉及TNF信號通路、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路等、Toll樣受體信號通路等，這些通路主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡相關(guān)（圖3）。結(jié)果表明銀翹散可通過多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的途徑治療上呼吸道感染。

表3 靶基因KEGG富集分析

圖3 銀翹散治療URTI的相關(guān)信號通路

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)突破了“一個(gè)藥物、一個(gè)靶點(diǎn)、一種疾病”的傳統(tǒng)藥物研發(fā)模式，通過采集數(shù)據(jù)信息，構(gòu)建“成分-疾病-靶點(diǎn)”相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析藥物對疾病的干預(yù)與影響，從而揭示藥物“多成分、多途徑、多靶點(diǎn)”協(xié)同作用于人體的分子機(jī)制[17]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選了銀翹散的活性成分群、潛在作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，為揭示銀翹散治療呼吸道感染的作用機(jī)制研究提供新策略和科學(xué)依據(jù)。

本研究首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取銀翹散所含的化學(xué)成分，確定了金銀花、連翹、薄荷、牛蒡子、甘草、荊芥穗、淡豆豉、桔梗和蘆根分別含有23、23、10、2、92、8、2、7 和 1 個(gè)有效活性成分。其主要活性成分包括了連翹脂、木犀草素、槲皮素、山柰酚、連翹醇、6-羥基黃酮、蘆薈大黃素和豆甾醇等。實(shí)驗(yàn)研究表明，銀翹散中君藥金銀花、連翹主要含有的木犀草素可有效抑制甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）衣殼蛋白I復(fù)合物的表達(dá)，阻止IAV進(jìn)入機(jī)體[18]，同時(shí)還可抑制M1巨噬細(xì)胞的極化，減少IL-6、IL-12和TNF-α等炎癥因子的生成[19]，有效減輕呼吸道的炎癥反應(yīng)。槲皮素可通過與呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）中M2-1蛋白的重要結(jié)構(gòu)域相互作用，有效阻止RSV的復(fù)制和增殖，進(jìn)而抑制病毒感染宿主[20]。山柰酚、連翹脂、豆甾醇等化合物不僅具有抗炎、抗氧化應(yīng)激，還有抗菌、抗病毒的作用[21-23]，提示銀翹散中的活性成分可通過協(xié)同作用的方式發(fā)揮治療URTI的作用。

通過明確“藥物-疾病”的117個(gè)交集靶點(diǎn)，然后將117個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析，結(jié)果提示銀翹散治療URTI的核心靶基因主要包括IL-6、TNF、TP53、MAPK1等。靶基因的 GO 和 KEGG 富集分析結(jié)果表明，GO功能主要涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物過程，KEGG分析結(jié)果主要富集在Toll樣受體、TNF、PI3K/Akt、HIF-1 等信號通路（圖 3）。其中，Toll樣受體信號通路負(fù)責(zé)識別感染源表面的模式蛋白并產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答，當(dāng)氣道發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，這條通路是連接先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵橋梁[24]；HIF-1α是HIF-1信號通路中的一種氧依賴性轉(zhuǎn)錄激活因子，在激活狀態(tài)下可促使發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[25]。Toll樣受體和HIF-1α均可激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的釋放，加重呼吸道的炎癥反應(yīng)，破壞呼吸道黏膜上皮屏障[26-28]。此外，TLRs可促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞中III型干擾素和IL-6的釋放，進(jìn)一步激活T細(xì)胞受體信號通路，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，抵御病原微生物的入侵。TNF信號通路主要參與細(xì)胞的生長、增殖、炎癥及免疫反應(yīng)，激活狀態(tài)下的TNF信號通路能夠刺激NF-κB入核，進(jìn)而激活NF-κB信號通路，促進(jìn)TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，損傷氣道上皮細(xì)胞，從而引起或加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)。閆樹麗[29]通過建立幼齡小鼠呼吸道合胞病毒肺炎模型，證實(shí)銀翹散和玉屏風(fēng)散可通過降低NF-κB和TNF-α的表達(dá)水平，有效的抑制炎癥反應(yīng)，防止呼吸道合胞病毒對肺組織的損傷。PI3K/Akt作為經(jīng)典的信號通路，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡中起到關(guān)鍵性的作用，當(dāng)呼吸道受到感染時(shí)，PI3K調(diào)控的下游通路被激活，進(jìn)一步影響絡(luò)氨酸激酶、整合素、B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。由此可見，銀翹散可通過調(diào)控上述相關(guān)信號通路，減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，從而改善呼吸道感染的狀況。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘了銀翹散治療上呼吸道感染的活性成分、潛在靶點(diǎn)及作用途徑，結(jié)果表明銀翹散含有連翹脂、木犀草素、槲皮素、山柰酚、連翹醇、豆甾醇等活性成分，這些活性成分作用于 IL-6、TP53、MAPK1、TNF 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，起到抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)道粘膜屏障的作用，主要通過干預(yù) Toll樣受體、TNF、HIF-1、PI3K/Akt等信號通路發(fā)揮作用，銀翹散治療上呼吸道感染作用機(jī)制的數(shù)據(jù)挖掘可為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)及指導(dǎo)。