李 珂，華玉美多，楊占婷，張得鈞，李占強*，樊海寧，蘆殿香***

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室，青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰外科，青海省包蟲病重點實驗室，青海 西寧 810001)

賽北紫堇(Corydalisimpatiens) 收錄于《中華本草》，藏藥名為“當(dāng)日絲哇”，無毛一年或兩年生草本，主要分布于青海等地。其為“扎桑”原植物，在藏藥成方中的入藥率高達25%。國內(nèi)外對其毒理學(xué)研究僅停留在大體階段，因此本研究對賽北紫堇總生物堿進行了急性及亞慢性經(jīng)口毒性研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

賽北紫堇購于青海中藏藥材市場，由青海大學(xué)張得鈞教授鑒定為Corydalisimpatiens(pall.)Fisch.賽北紫堇。

昆明小鼠：20.0±2 g，150只，雌雄各半，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2017-003。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(貨號：C009-2)、谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒(貨號：C010-2)、肌酐試劑盒(貨號：C011-2-1)、總膽固醇試劑盒(貨號：A111-1-1)、甘油三酯試劑盒(貨號：A110-1)、血尿素氮試劑盒(貨號：C013-1)、白蛋白試劑盒(貨號：A028-2)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 賽北紫堇總生物堿制備

取賽北紫堇干燥地上部分30 kg，用85%乙醇閃式提取。乙醇提取液經(jīng)濃縮至無乙醇味，加稀鹽酸酸化(至pH3)，用石油醚萃取脫脂，萃余相用10%氨水堿化(至pH10)，靜置12 h，取沉淀部位干燥后獲得賽北紫堇總生物堿(648.2g)。

1.2.2 賽北紫堇總生物堿急性毒性試驗

根據(jù)我國《食品安全標準 急性經(jīng)口毒性試驗》(GB 15193.3-2014)標準，應(yīng)用寇氏(Korbor)法研究。以李海麗等[1]測得的半數(shù)致死量(medianlethaldose，LD50)為參考，選擇的預(yù)實驗劑量分別為350.0、250.0、178.6、127.6、91.0、65.0、46.4、32.8、23.0 mg/kg，對數(shù)等距。每組4只，雌雄各半，灌胃給藥(僅1次)后觀察14天內(nèi)的反應(yīng)，得到的絕對致死量(absolute lethal dose，LD100)與最大耐受劑量(maximal tolerance dose，LD0)為最高劑量與最低劑量。

取小鼠60只，根據(jù)預(yù)實驗中獲得的最高劑量與最低劑量，將其分為5個對數(shù)等距劑量組：100.0、67.0、47.8、29.9、20.0 mg/kg，每組12只，雌雄各半。根據(jù)我國《食品安全標準 急性經(jīng)口毒性試驗》(GB 15193.3-2014)標準中的寇氏法計算LD50及其可信限。

1.2.3 賽北紫堇總生物堿亞慢性毒性試驗

亞慢性毒性實驗分為4組：空白組，賽北紫堇總生物堿低劑量(5.0mg/kg)、中劑量(10.0mg/kg)、高劑量組(20.0mg/kg)。每組12只，雌雄各半，自由飲食。每日灌胃1次。末次給藥后禁食，但予自由飲水。12 h后于眼球取血，取適量血液于含有肝素鈉的離心管用半自動血液生化分析儀進行血液生理指標分析，用無肝素鈉離心管中的血液制備血清用于生化指標分析。采血后解剖，取小鼠的心、肝、脾、肺、腎，計算臟器指數(shù)，并用4%多聚甲醛固定，行常規(guī)蘇木素-伊紅(Hematoxylin and Eosin，HE)染色、封片，用顯微鏡觀察結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 實驗結(jié)果

2.1 賽北紫堇總生物堿急性毒性試驗

通過預(yù)實驗測得賽北紫堇總生物堿LD100為91.0 mg/kg，LD0為23.4 mg/kg。在正式試驗中最高劑量和最低劑量設(shè)為100.0 mg/Kg和20.0 mg/kg。根據(jù)最高劑量和最低劑量對數(shù)差，設(shè)置5個對數(shù)等距的灌胃劑量：100.0、67.0、47.8、29.9、20.0 mg/kg。見表1。

表1 寇式法測定LD50實驗結(jié)果Table 1 The test result of LD50 determined by Korbor method

表1為寇氏法測定賽北紫堇總生物堿致死率結(jié)果，并計算LD50，為42.9 mg/kg，可信限為33.8～54.5。

2.2 賽北紫堇總生物堿對小鼠的亞慢性毒性試驗

2.2.1 賽北紫堇總生物堿對小鼠體重與臟器指數(shù)的影響

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，中劑量組雌鼠體重與空白組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。雌鼠體重明顯低于雄鼠，且高、中、低劑量組的雌鼠與雄鼠之間存在統(tǒng)計學(xué)差異。見表2。

表2 賽北紫堇總生物堿對小鼠體重的影響值Table 2 Effects of total alkaloids of C.impatiens on Murine body

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，雄鼠中劑量組，雌鼠低、中、高劑量組心臟指數(shù)低于空白組；雄鼠低、高劑量組的肺指數(shù)低于空白組。見表3。

表3 賽北紫堇總生物堿對小鼠臟器指數(shù)的影響值Table 3 Effects of total alkaloids of C.impatiens on viscera index in

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)

2.2.2 賽北紫堇總生物堿對小鼠血液學(xué)及生化指標的影響

小鼠連續(xù)灌胃給藥28 d后，與空白組相比，藥物組雌鼠的白細胞數(shù)(WBC)、單核細胞數(shù)(Mon)、中性粒細胞值(Neu)、嗜堿性粒細胞值(Eas)、淋巴細胞數(shù)(Lym)明顯升高；雌鼠低、高劑量組的嗜酸性粒細胞絕對值(Eos)升高。雄鼠的Neu、Bas與空白組相比升高；低劑量組Eos與空白組相比升高；低、高劑量組的Lym與空白劑量組相比升高。

雌鼠紅細胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、紅細胞分布寬度變異系數(shù)(RDW-CV)、紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)與空白組相比明顯升高；低、中劑量組的血小板(PLT)顯著升高。雄鼠RBC、HGB、HCT、RDW-CV、RDW-SD、PLT與空白組相比明顯升高。

雌鼠空白組的WBC、Lym低于雄鼠空白組，而雌鼠低、中劑量組的WBC、Lym高于雄鼠；空白組與藥物組的Mon雌鼠均低于雄鼠；空白組與低劑量組的Neu雌雄小鼠存在差異，雌鼠低于雄鼠，而高劑量組雌鼠高于雄鼠；空白組中雌鼠的Eos高于雄鼠；低劑量組雌鼠的RDW-CV、PLT高于雄鼠；低、高劑量組雌鼠的RDW-SD高于雄鼠。見表4。

表4 賽北紫堇總生物堿對小鼠血液指標的影響值Table 4 Effects of total alkaloids of C.impatienson blood indexes in

續(xù)表：

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

血液生化指標分析發(fā)現(xiàn)，賽北紫堇總生物堿對雌鼠的影響較大。雌鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)高于空白組；雌鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)低、中劑量組與空白組有顯著性差異；甘油三酯(TG)中、高劑量組均顯著高于空白劑量組。雄鼠的ALT低、中劑量組均與空白組有顯著性差異，且低、中劑量組均小于空白劑量組；高、低劑量組AST低于空白劑量組；雄鼠3個劑量組的ALB與空白組比均升高。

雌鼠中、高劑量組尿素氮(BUN)均顯著高于空白劑量組(P<0.05)；雌鼠中、高劑量組比空白組高；肌酐(CRE)高劑量組低于空白組。雄鼠高劑量組的CRE高于空白組。

雌鼠空白組ALT低于雄鼠，而中劑量組雌鼠高于雄鼠；雌鼠空白組與低、中、高劑量組的AST、BUN相比均高于雄鼠。雌鼠的ALB均低于雄鼠；空白組與低劑量組雌鼠的CRE高于雄鼠；雌鼠TG高于雄鼠。

上述數(shù)據(jù)見表5。

表5 賽北紫堇總生物堿對血液生化指標的影響值Table 5 Effect of total alkaloids of C.impatiens on blood biochemical

續(xù)表：

* ：表示與空白組比較差異顯著(P<0.05)，#：表示同一劑量下雌雄之間差異顯著(P<0.05)

2.2.3 賽北紫堇總生物堿對小鼠器官組織病理變化的影響

組織病理切片顯示，空白組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等臟器的組織結(jié)構(gòu)均正常。相對于空白組，賽北紫堇總生物堿使雌鼠高劑量組心肌間質(zhì)增寬，見圖1。

藥物組血細胞增多，雌性小鼠的肺泡隔增厚；低劑量組支氣管炎癥細胞增多；中、高劑量組中可見明顯滲出液及肺泡融合現(xiàn)象，出現(xiàn)炎癥浸潤現(xiàn)象。雄性小鼠肺泡隔變薄，出現(xiàn)明顯炎癥浸潤現(xiàn)象，且雄鼠中劑量、高劑量組支氣管出現(xiàn)大量炎性細胞。見圖2。

雌鼠低劑量組肝血竇增多，肝索結(jié)構(gòu)模糊，局部水腫；中、高劑量組肝細胞核萎縮，產(chǎn)生水腫。雄鼠低、高劑量組肝索模糊，肝細胞核萎縮，產(chǎn)生水腫，局部有嗜酸性變。雌鼠低劑量組肝索結(jié)構(gòu)模糊較雄鼠嚴重，水腫現(xiàn)象較雄鼠輕；雌鼠中劑量組核萎縮、水腫現(xiàn)象較雄鼠嚴重；雄鼠炎癥浸潤較雌鼠嚴重。雌、雄小鼠均有炎癥反應(yīng)。見圖3。

藥物組中，雌鼠的脾臟較為疏松；高劑量組有局部纖維化，炎癥細胞較多。雄鼠脾臟的紅髓、白髓無明顯損傷，雄鼠中、高劑量組有輕微炎癥。見圖4。

與空白組對比，雌鼠3個劑量組呈現(xiàn)凝固性壞死。雄鼠低劑量組腎小體淡化，邊界模糊，遠曲小管與近曲小管縮小，中、高劑量組呈現(xiàn)凝固性壞死。雌鼠的腎臟壞死較雄鼠嚴重。見圖5。

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)圖1 小鼠心臟組織的病理變化圖(HE，×400)Figure 1 Histopathological changes in the heart of mice(HE，×400)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

A：空白組；B：低劑量組(5mg/kg)；C：中劑量組(10mg/kg)；D：高劑量組(20mg/kg)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，急性小鼠出現(xiàn)中毒表現(xiàn)；亞慢性小鼠肝、腎損傷嚴重，且雌鼠損傷大于雄鼠。本研究測得的LD50與李海麗等[1]測得的LD50有一定差異，可能與提取方法有關(guān)。

對小鼠的亞慢性毒性研究數(shù)據(jù)表明：賽北紫堇總生物堿對雌鼠體重的增長具有抑制作用，且給藥組雌性小鼠體重較雄鼠低。對小鼠的心、肝、脾、腎的臟器指數(shù)無顯著性影響，雄性小鼠低、高劑量組肺組織指數(shù)降低。根據(jù)血液生理指標測定，發(fā)現(xiàn)賽北紫堇總生物堿對雌鼠的WBC、Neu、Lym、Mon、Eas影響明顯(升高)，可能存在炎癥反應(yīng)與水腫。與HE切片相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)雌鼠肺、肝、脾、腎臟炎性細胞增多，具有炎癥浸潤現(xiàn)象。雌鼠RBC、HGB、HCT、RDW-CV、RDW-SD升高，可能與小鼠缺氧或肺部炎癥有關(guān)。雄鼠Neu、Bas、RBC、HCT、RDW-CV、RDW-SD升高，可能存在炎癥浸潤。通過血清生化指標進一步驗證發(fā)現(xiàn)AST、ALT、BUN、CRE、ALB、TG均有變化，雌鼠中、高劑量的ALT、TG有明顯升高，低、中劑量組的AST升高，可能會增加肝臟負擔(dān)，導(dǎo)致肝臟損傷[2]。雄鼠低、中劑量的ALT，低、高劑量組的AST降低，可能是肝臟存在炎癥所致[3]。雌、雄鼠各個組之間均有差異，而不同性別的ALT、AST空白組指標存在明顯差異，與血液生理學(xué)指標結(jié)合，顯示賽北紫堇總生物堿對小鼠肝臟具有損傷性。雄鼠ALB升高與小鼠肝臟損傷有關(guān)。雌鼠中、高劑量組的BUN顯著升高，高劑量組的CRE降低與腎功能有關(guān)；病理切片觀察結(jié)合上述指標研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺、肝、脾組織存在炎癥反應(yīng)；雌性肝、腎小鼠炎癥浸潤較雄鼠嚴重。小鼠腎小體結(jié)構(gòu)淡化或消失，有局部壞死；雌鼠腎臟凝固性壞死較雄鼠嚴重。上述結(jié)果顯示賽北紫堇總生物堿對小鼠的腎臟、肝臟損傷較為明顯。

賽北紫堇中含有大量異喹啉類生物堿，已報道23個，niuxiaofeng等對其中11種生物堿含量進行了測定，其中bicuculine與protopine較高，為賽北紫堇總生物堿的總成分，且發(fā)現(xiàn)藏地不同區(qū)域的塞北紫堇總生物堿主成分存在差異[4-5]。國內(nèi)外對賽北紫堇總生物堿與其生物堿類成分的毒理學(xué)研究極少，因此在后續(xù)研究過程中，應(yīng)當(dāng)進一步明確主要毒性物質(zhì)，為藥材的質(zhì)量控制標準提供可靠依據(jù)。

綜上所述，賽北紫堇總生物堿對雌雄小鼠的影響存在性別差異(雌鼠損傷大于雄鼠)；急慢性方面：急性小鼠出現(xiàn)中毒表現(xiàn)；亞慢性小鼠肝、腎損傷嚴重。