江 濤，毛厚平，何彥豐，陳文煒，高星健，張 華

腎結(jié)石外科治療手段日益多樣化，但目前仍沒有預(yù)防其發(fā)生和復(fù)發(fā)的有效方法。腎結(jié)石最常見的成分是草酸鈣結(jié)石[1]。已知有多種因素在多個環(huán)節(jié)參與草酸鈣腎結(jié)石的生成。研究認為，高草酸尿能誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生，損傷腎小管上皮細胞，并誘導(dǎo)細胞膜磷脂酰絲氨酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促使草酸鈣結(jié)晶粘附于腎小管上皮細胞表面[2]；而后受損細胞逐步變?yōu)樗槠又蠓肿游镔|(zhì)迅速牢固粘附，最終啟動結(jié)石形成的級聯(lián)反應(yīng)。近年來，核因子E2相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF-2)誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase,HO-1)的表達被認為是細胞內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激機制之一。上調(diào)此信號通路可維持細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，發(fā)揮細胞保護作用[3]。

許多中藥成分可通過上調(diào)NRF-2/HO-1通路阻斷氧化應(yīng)激發(fā)生。姜黃素為中藥姜黃的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、減慢鈣沉積速率的生物活性[4]。本研究采用乙醛酸鹽腹腔注射方法建立大鼠腎草酸鈣結(jié)晶模型，觀察姜黃素干預(yù)對腎結(jié)石形成的影響，并通過大鼠相關(guān)生化指標、腎臟組織氧化應(yīng)激指標及腎小管上皮細胞凋亡情況評價造模情況和治療效果，探討姜黃素對大鼠草酸鈣結(jié)晶性腎損傷模型的保護性作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 雄性C57BL/6大鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量(225±25)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(許可證號:SCXK2012-0003)。大鼠常規(guī)飼料喂養(yǎng)，正常飲水，飼養(yǎng)房溫度為(20±3)℃，濕度為35%～55%，光照10 h/d。

1.1.2試劑和儀器 試劑：乙醛酸鹽[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；姜黃素、橄欖油及丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司)；腎臟細胞凋亡DNA片段測定試劑盒、兔NRF-2及HO-1多克隆抗體(美國Sigma公司)；馮庫薩(VON KOSSA)染色試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)；蛋白印跡發(fā)光試劑盒(美國Cell Signaling公司)；BCA法蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)。儀器：超低溫冰箱(U85-13型，美國Thermo公司)；自動生化分析儀(Aul000型，日本Olympus公司)；核酸蛋白分析儀(DU-800型，德國Beckman公司)；穩(wěn)壓垂直電泳儀(Powerpac通用型，美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型制作 采用系統(tǒng)隨機化法將40只大鼠均分為5組：(1)空白對照組：自由飲用去離子水+橄欖油1 mL灌胃；(2)單純結(jié)晶組(模型組)：100 mg·kg-1·d-1乙醛酸鹽腹腔注射+橄欖油1 mL灌胃；(3)低、中、高劑量姜黃素干預(yù)+結(jié)晶組：100 mg·kg-1·d-1乙醛酸鹽腹腔注射+姜黃素20，40和60 mg·kg-1·d-1橄欖油溶液1 mL灌胃[5]。

1.2.2尿液和血液生化指標檢測 分組干預(yù)4周后，將各組大鼠放入代謝籠中，收集每只大鼠24 h尿液，抽取全血樣本。應(yīng)用生化分析儀檢測尿離子鈣濃度以及血清肌酐(serum creatinine,SCr)濃度。分別采用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測定尿草酸。

1.2.3腎臟組織相關(guān)檢測 留取血、尿樣本后，處死大鼠，取雙側(cè)腎臟，稱取質(zhì)量。將一側(cè)腎臟制作切片，一部分經(jīng)VON KOSSA染色觀察腎組織鈣鹽的分布，并計算腎結(jié)晶沉淀評分。評分標準：無結(jié)晶沉積為0分；結(jié)晶位于腎髓質(zhì)為1分；結(jié)晶位于皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處為2分；結(jié)晶位于皮質(zhì)部為3分；如果結(jié)晶多部位存在，則各部位分值相加得出單個腎臟鈣鹽結(jié)晶分值。另取一部分切片采用免疫組織化學(xué)細胞凋亡染色(TUNEL法)觀察腎小管上皮細胞的凋亡情況，每一張切片至少計數(shù)500個細胞，計算陽性細胞數(shù)，以百分數(shù)表示凋亡指數(shù)。

1.2.4腎臟MDA含量和HO-1活性檢測 取部分腎臟組織勻漿，采用比色法測定腎臟組織的MDA含量，具體操作步驟按照MDA測試盒說明進行。另取部分勻漿，測定樣品反應(yīng)物中的膽紅素生成量，代表HO-1活性。冰上勻漿，4 ℃下離心20 min，取上清100 μL，分別加入膽綠素還原酶4 mg以及還原型輔酶Ⅱ，加入pH為7.4的磷酸鉀緩沖液至1 mL，充分混勻，37 ℃水浴，避光反應(yīng)20 min，冰浴終止反應(yīng)。測定波長為463和530 nm的吸光度差值，以膽紅素生成量反映HO-1活性。

腎臟組織MDA含量(nmol/mg pro)=(A測定管-A標準空白管)÷(A標準管-A標準空白管)×標準品濃度(10 nmol/mL)÷樣本蛋白含量(mg pro/mL)

HO-1活性(nmol·mg-1·h-1)=[(A460-A530)/(蛋白含量×40)]×106

1.2.5Western-blot檢測腎臟NRF-2和HO-1蛋白的表達 提取胞內(nèi)蛋白，沸水浴使蛋白質(zhì)變性，各組蛋白和Marker分別上樣后行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉封閉5 h后與兔抗NRF-2多克隆抗體(1∶500)、兔抗HO-1多克隆抗體(1∶2 000)和β-actin抗體結(jié)合，4 ℃過夜，洗膜后雜交2 h，顯影。通過掃描儀灰度掃描后，用Quantity one 4.6.6版圖像分析軟件進行分析，以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值與內(nèi)參照β-actin的相應(yīng)條帶灰度值的比值表示NRF-2及HO-1的含量相對值。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素對各組大鼠尿離子鈣和尿草酸表達濃度的影響 模型組大鼠的尿離子鈣和尿草酸濃度比空白對照組大鼠顯著升高(P<0.05)，說明造模成功。姜黃素干預(yù)組大鼠的尿離子鈣濃度和尿草酸與模型組比較，差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2姜黃素對各組大鼠SCr濃度的影響 模型組大鼠的SCr濃度比空白對照組顯著升高(P<0.05)；隨著姜黃素干預(yù)劑量的增加，姜黃素干預(yù)組大鼠的SCr水平呈下降趨勢，與模型組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各干預(yù)組間差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3姜黃素對各組大鼠腎臟組織相關(guān)檢測指標的影響

2.3.1腎小管上皮細胞凋亡指數(shù) 模型組大鼠的腎小管上皮細胞凋亡指數(shù)比空白對照組顯著升高(P<0.05)；隨著姜黃素干預(yù)劑量的增加，姜黃素干預(yù)組大鼠的腎小管凋亡指數(shù)逐漸降低，與模型組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，各干預(yù)組間差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3.2腎臟草酸鈣結(jié)晶形成情況 光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎臟組織中見大量黑色鈣鹽結(jié)晶呈片狀連接，在腎皮質(zhì)、髓質(zhì)及乳頭均可見，結(jié)晶沉淀評分結(jié)果與空白對照組比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而姜黃素干預(yù)組大鼠僅在腎小管腔及皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處出現(xiàn)黑色鈣鹽結(jié)晶，且隨著干預(yù)劑量的增加，結(jié)晶逐漸減少，結(jié)晶沉淀評分結(jié)果各干預(yù)組與模型組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各干預(yù)組間差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3.3腎臟組織中MDA含量和HO-1活性 模型組大鼠腎臟組織中MDA含量比空白對照組明顯升高(P<0.05)，而HO-1活性比空白對照組明顯下降(P<0.05)。隨著姜黃素干預(yù)劑量的增加，各干預(yù)組大鼠腎臟組織中MDA含量呈下降趨勢，而HO-1活性呈升高趨勢，與模型組比較，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各干預(yù)組間差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3.4腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白 模型組大鼠腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白均比空白對照組明顯降低(P<0.05)。隨著姜黃素干預(yù)劑量的增加，各干預(yù)組大鼠腎臟組織中NRF-2和HO-1蛋白表達水平呈升高趨勢，與模型組差別均有統(tǒng)計學(xué)意義，各干預(yù)組間差別也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1，表1)。

3 討 論

對于潛在的可能罹患結(jié)石的高風(fēng)險患者，在未進展至臨床腎結(jié)石之前，其體內(nèi)可能已存在因氧化應(yīng)激狀態(tài)異常而導(dǎo)致的腎小管上皮損傷。當組織細胞中氧化應(yīng)激持續(xù)產(chǎn)生及活性氧簇生成過多時，刺激腎小管上皮細胞的細胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致腎小管上皮細胞受損[6]。受損細胞為早期微石形成提供有效結(jié)合點，促進腎臟小管上皮與結(jié)晶體的粘附、聚集及生長，最終啟動結(jié)石生成級聯(lián)反應(yīng)[7]。MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一，可以導(dǎo)致膜脂過氧化，損傷生物膜結(jié)構(gòu)，使得細胞膜結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，是考察細胞受氧化應(yīng)激嚴重程度的指標之一。Hirose等在大鼠草酸鈣腎結(jié)晶模型上發(fā)現(xiàn)MDA的脂質(zhì)過氧化作用比正常大鼠明顯升高[8]。本研究表明，乙醛酸鹽誘導(dǎo)大鼠MDA和SCr明顯升高，提示其腎小管上皮細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致腎功能受損；姜黃素干預(yù)則可顯著降低MDA和SCr水平，且成劑量依賴關(guān)系，這可能與其具有抗脂質(zhì)過氧化功能有關(guān)[9]。姜黃素具有抗氧化、抗炎和抗自由基作用。本研究結(jié)果也證實，姜黃素在一定程度上保護腎小管上皮細胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而阻止草酸鈣結(jié)晶進一步聚集形成結(jié)石。多項研究表明，姜黃素對乙二醇誘導(dǎo)的腎臟草酸鈣結(jié)石形成具有明顯預(yù)防效果[4,10]。

1：空白對照組；2：模型組；3～5：低、中、高劑量姜黃素(20，40，60 mg·kg-1·d-1)干預(yù)組.NRF-2：核因子E2相關(guān)因子2；HO-1：血紅素加氧酶-1.圖1 Western-blot檢測各組大鼠NRF-2和HO-1蛋白表達情況Fig 1 NRF-2 and HO-1 protein expression of rats in each group detected by Western-blot

表1 各組大鼠生化、氧化應(yīng)激和凋亡指標檢測結(jié)果Tab 1 Examination parameters of rats on biochemical,oxidative stress and apoptosis indexes in each group

n=8.MDA：丙二醛；HO-1：血紅素加氧酶-1；NRF-2：核因子E2相關(guān)因子-2.與空白對照比較，▲：P<0.05；與模型組比較，☆：P<0.05；與20 mg·kg-1·d-1姜黃素組比較，△：P<0.05；與40 mg·kg-1·d-1姜黃素組比較，○：P<0.05.

NRF-2是具有基本亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子。目前認為，NRF-2是調(diào)控細胞對抗氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。NRF-2通過與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合而啟動HO-1基因轉(zhuǎn)錄，阻斷脂質(zhì)過氧化物的發(fā)生和發(fā)展，從而對抗脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生的細胞損害作用。而HO-1是細胞對于氧化應(yīng)激的適應(yīng)反應(yīng)，能有效消除氧自由基，抑制細胞脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化活性，減輕線粒體損傷，保護內(nèi)皮細胞免受過氧化物侵害引起的細胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，當連續(xù)給予大鼠乙醛酸鹽干預(yù)4周后，模型組的MDA、SCr和腎結(jié)晶程度均比對照組明顯升高，提示模型組大鼠體內(nèi)存在較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)及鈣代謝異常，高濃度尿草酸可誘導(dǎo)腎臟組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，造成腎小管上皮細胞膜過氧化，使細胞凋亡、脫落，基膜暴露，致使草酸鈣結(jié)晶粘附其表面，啟動結(jié)石形成。這與Bodakhe等的研究結(jié)果一致[12]。研究同時發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的NRF-2及HO-1的表達水平均較對照組大鼠顯著下降，原因可能是機體對抗氧化應(yīng)激的自我保護反應(yīng)逐漸消耗衰減，最終導(dǎo)致腎小管上皮細胞的損害及凋亡以及腎功能的損害。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素雖然無法降低尿草酸水平，但大鼠NRF-2及HO-1的表達水平均較模型組組明顯上升，且隨著姜黃素濃度的增加，大鼠腎小管上皮細胞損傷程度、腎結(jié)晶程度、尿中尿素氮及SCr的上升水平和大鼠NRF-2及HO-1表達水平的下降趨勢均較模型組明顯延緩。

本研究表明，姜黃素可通過上調(diào)NRF-2/HO-1蛋白表達，增強上游NRF-2和下游HO-1的表達，減輕大鼠草酸鈣結(jié)晶引起的氧化應(yīng)激腎損傷，保護腎小管上皮細胞，減少草酸鈣結(jié)晶形成。但姜黃素的作用機制還可能涉及更多的通路環(huán)節(jié)，仍需進一步探討。