蔡紅霞，丁 妍，邢 宇

0 引言

缺血再灌注損傷的發(fā)生與多因素、多機制參與并相互作用有關(guān)，目前對其研究多集中在心、腦等重要器官。任何器官在缺血再灌注后均可能發(fā)生不同程度的損傷，子宮在卵巢腫瘤、子宮腫瘤、引產(chǎn)、正常分娩及產(chǎn)后等的治療過程中也可能發(fā)生生殖系統(tǒng)缺血再灌注損傷，其中又以剖宮產(chǎn)、胎盤早期剝離、流產(chǎn)、引產(chǎn)、子宮破裂等手術(shù)引起的缺血再灌注損傷更加嚴(yán)重[1-2]，是目前女性生命及生殖安全中不容忽視的問題，但目前針對子宮缺血再灌注損傷的機制和藥物研究較少，故研究子宮缺血再灌注損傷機制、尋找或篩選已知藥物對子宮缺血再灌注損傷的治療作用，對預(yù)防產(chǎn)后損傷具有一定的臨床意義。益母草又名茺蔚、坤草、九重樓、云母草等，其新鮮或干燥地上莖或葉中富含益母草素、二萜類、黃酮類、脂肪酸類生物堿類[3-4]。其主要藥理活性成分為益母草素，具有促進產(chǎn)后子宮復(fù)原、收縮子宮、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凝等作用，臨床常利用其利尿消腫、清熱涼血、活血調(diào)經(jīng)之功效來治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后止血、惡露不盡等婦科疾病[5-6]。本研究在建立大鼠子宮缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，以益母草灌流缺血再灌注損傷子宮平滑肌，觀察其對子宮平滑肌能量代謝及子宮活動力的影響，為預(yù)防和治療產(chǎn)后子宮損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性健康SD大鼠共40只，SPF級，體重160～170 g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院動物中心并在該中心標(biāo)準(zhǔn)實驗室進行相關(guān)實驗，實驗室設(shè)施合格證：SYXK(鄂)2018-001，實驗動物質(zhì)量合格證：SCXK(鄂)2018-001。遵偱3R原則，實驗過程中充分保證動物福利、給予動物人道關(guān)懷。大鼠自由飲水并飼以顆粒飼料，動物房12 h交替光照，相對濕度保持在75%左右，怛溫22～24 ℃。

1.2 主要藥品與設(shè)備 益母草注射液購自成都第一制藥有限公司(批號：Z51021448)；肝素鈉注射液購自天津生物化學(xué)制藥有限公司(批號：H12020505)；戊巴比妥鈉購自北京化學(xué)試劑公司(批號：060222)；LC-10T高效液相色譜儀和721型分光光度計購自賽智科技杭州有限公司；FT-1000生物張力傳感器和BL420F生物電信號采集系統(tǒng)由成都泰盟科技有限公司提供；總腺嘌呤核苷酸(Total adenine nucleotides,TAN)、磷酸腺苷(Adenosine monophosphate,AMP)、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)和三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)考馬斯亮藍(lán)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司(批號：s18047，s18044，s18049)；線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性測試盒由北京索萊寶科技有限公司提供(批號：BC0515)。

1.3 模型構(gòu)建與分組 手術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，挑選30只體重相近的大鼠，隨機均分為模型組、縮宮素組和益母草組。三組動物均于術(shù)前1 d按2 U/鼠的劑量腹腔注射雌二醇，然后禁食6 h但不禁水。用3%戊巴比妥鈉(0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，腹部向上固定，下腹部至恥骨聯(lián)合處剃毛后消毒，縱形切開皮膚，然后再切開腹白線，暴露大鼠膀胱及子宮，用棉簽小心向上推離膀胱，分開腸管，可見到粉紅色子宮。從大隱靜脈注射0.1 ml肝素鈉注射液(500 U)，5 min后游離出大鼠腹腔動脈，向下分離出髂總動脈，注意避免損傷髂腰動、靜脈致動物大出血。然后在腹腔動脈與髂總動脈分叉處上方0.5 cm處，用4-0號手術(shù)線結(jié)扎腹腔動脈，阻斷子宮血供，30 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注45 min即可成模[7]。另取10只于實驗前1 d按2 U/鼠的劑量腹腔注射雌二醇，但不手術(shù)建模的大鼠，設(shè)為假手術(shù)組。

1.4 離體子宮平滑肌取樣方法 于再灌注45 min后，分離出V形子宮并游離兩側(cè)子宮角，用眼科剪從陰道與子宮匯合處剪斷，可得到2條子宮，將離體子宮置于裝有4 ℃、通有95% O2和5% CO2泡合樂氏液的培養(yǎng)皿中備用。

1.5 離體子宮平滑肌灌流記錄子宮活動力 取上述備用的右側(cè)子宮，分離掉子宮圓韌帶和子宮附著的脂肪，將子宮剪成子宮平滑肌條(長約3 cm)。用4-0號絲線結(jié)扎，然后將子宮平滑肌條一端固定在水浴鍋通氣鉤上，另一端連接FT-1000生物張力傳感器，將子宮平滑肌條置于pH 7.3～7.5的樂氏液(10 ml)的恒溫浴槽內(nèi)，浴槽溫度恒定于(30±1)℃，通95% O2和5% CO2的混合氣體，將通氣量調(diào)整為2個氣泡/s。然后給標(biāo)本加1 g前負(fù)荷，以保證子宮平滑肌處于比較穩(wěn)定的活動狀態(tài)，平衡30 min，其間每10 min換樂氏液1次，共3次，然后開始用相應(yīng)的藥物灌流并用BL420F生物電信號采集系統(tǒng)記錄離體子宮平滑肌收縮頻率、收縮張力，計算離體子宮活動力。其中模型組和假手術(shù)組在浴槽中加入0.1 ml生理鹽水對照，縮宮素組在浴槽中加入0.1 ml縮宮素注射液，益母草組在浴槽中加入0.1 ml益母草注射液，分別記錄離體子宮平滑肌的收縮頻率和收縮張力，并據(jù)此計算離體子宮活動力。離體收縮張力：以每次子宮平滑肌收縮所達到的最高點來表示(g)。離體收縮頻率：以每分鐘子宮平滑肌收縮的次數(shù)表示(次/min)。離體子宮活動力=收縮張力×收縮頻率。

1.6 高能磷酸化合物(Energy rich phosphate compounds,EPC)水平和Ca2+濃度檢測 在離體子宮平滑肌灌流實驗結(jié)束后，取子宮平滑肌標(biāo)本，剪成3段，取其中一段用濾紙吸干，用4 ℃的HEPES沖洗液沖洗后制成組織勻漿，高速離心機離心力調(diào)到3 000 r/min，離心15 min后取上清分裝備檢。采用考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒檢測子宮組織EPC中AMP、ADP和ATP含量；然后計算TAN總量(TAN=ATP+ADP+AMP)。取其中一段組織，采用原子吸收光譜法檢測子宮平滑肌組織中Ca2+濃度。

1.7 線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ活性 用線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性測試盒檢測離體子宮平滑肌標(biāo)本線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ含量，操作步驟：取其中一段子宮組織，準(zhǔn)確稱取10 mg，按試劑盒說明書操作步驟進行檢測：加入1 ml試劑1和10 μl試劑3，用研缽研磨后勻漿。4 ℃下勻漿3 000 r/min離心5 min。棄去沉淀組織，取上清液50 μl移至另一離心管中，4 ℃下以6 000 r/min離心力離心10 min。取上清液加入2 μl試劑3和200 μl試劑2，然后超聲波破碎后編號待測。分光光度法：分光光度計預(yù)熱30 min，波長調(diào)至340 nm，用蒸餾水調(diào)零。將上述待測樣本37 ℃孵育5 min。將孵育后備測樣本取40 μl加入石英比色皿中比色，記錄340 nm處初始吸光值A(chǔ)1和2 min后的吸光值A(chǔ)2，計算公式：ΔA(待測樣本吸光度值)=A1-A2。

2 結(jié)果

2.1 不同灌流方法對缺血再灌注后離體子宮平滑肌活動力和Ca2+濃度的影響 假手術(shù)組可記錄到離體子宮平滑肌的正常生理活動(如收縮張力、收縮頻率)。與假手術(shù)組比較，模型組缺血再灌注后離體子宮平滑肌活動力降低，標(biāo)本收縮張力、收縮頻率和子宮活動力、Ca2+濃度均低于假手術(shù)組(P<0.05)。縮宮素組和益母草組分別灌流縮宮素注射液和益母草注射液后，收縮張力、收縮頻率和子宮活動力均明顯升高，但沒有恢復(fù)到假手術(shù)組水平(P<0.05)，與模型組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ca2+濃度明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？s宮素組和益母草組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 不同灌流方法對缺血再灌注離體子宮平滑肌EPC水平的影響 與假手術(shù)組比較，模型組ADP、AMP、ATP、TAN均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？s宮素組ADP、AMP、ATP、TAN有一定程度升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。益母草組ADP、AMP、ATP、TAN明顯升高，與模型組和縮宮素組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 益母草對缺血再灌注離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ的影響 與假手術(shù)組比較，模型組離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ均明顯降低，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？s宮素組離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ有一定程度升高，但Ⅰ～Ⅳ活性未升高到對照組水平，與對照組和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。益母草組離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ明顯升高，與模型組和縮宮素組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 四組缺血再灌注后離體子宮平滑肌活動力比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 四組缺血再灌注后離體子宮平滑肌EPC水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與縮宮素組比較，△P<0.05

表3 四組缺血再灌注后離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ含量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與縮宮素組比較，△P<0.05

3 討論

益母草具有利水消腫、活血調(diào)經(jīng)之功效，常用于治療產(chǎn)后腹痛、月經(jīng)不調(diào)、水腫及尿不利等。益母草注射液是從益母草全草中提取的單方制劑，對子宮有較強的興奮作用，臨床常與縮宮素聯(lián)合使用，用于預(yù)防或治療流產(chǎn)及產(chǎn)后子宮出血[8-9]。

子宮有創(chuàng)檢查、子宮破裂、流產(chǎn)引產(chǎn)、胎盤早期剝離、子宮外傷、剖宮產(chǎn)等均可能伴發(fā)子宮術(shù)后缺血再灌注損傷[10-11]。缺血再灌注損傷是一個多因素參與、多機制共同作用的復(fù)雜病理生理學(xué)過程，自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、免疫狀態(tài)異常、鈣超載等均是引起組織器官缺血再灌注損傷的始動因素[12-13]。除上述氧化應(yīng)激反應(yīng)作用外，子宮缺血再灌注損傷還與能量代謝異常有一定的關(guān)系。盡管子宮術(shù)后缺血再灌注損傷對子宮造成的嚴(yán)重危害會影響到子宮的生殖功能，但目前臨床上還未引起足夠重視。

細(xì)胞呼吸鏈?zhǔn)菣C體能量代謝過程的重要環(huán)節(jié)，主要由4種酶復(fù)合體即復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組成，是線粒體這一連續(xù)反應(yīng)體系最基本的功能。細(xì)胞呼吸鏈由一系列的遞電子反應(yīng)和遞氫反應(yīng)按一定的順序發(fā)生反應(yīng)后生成水和ATP，其本質(zhì)是輔酶、酶、輔因子或輔基參與機體的代謝功能，當(dāng)不同外因引起線粒體呼吸鏈酶被阻斷或抑制后，如組織缺血缺氧、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物缺陷及呼吸鏈抑制劑等均可阻斷或抑制呼吸鏈遞電子反應(yīng)和遞氫反應(yīng)中的電子傳遞，引起機體迅速死亡。ATP由線粒體生成，其內(nèi)膜/外膜及基質(zhì)上酶復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的含量及活性在細(xì)胞能量代謝的過程中起著極其重要的作用，線粒體功能障礙在子宮術(shù)后缺血再灌注損傷能量代謝失衡中起重要作用[14-15]。因此，檢測子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ的活性可以確定子宮缺血再灌注損傷時子宮平滑肌的能量代謝狀況。本研究顯示，益母草組離體子宮平滑肌線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ明顯升高，提示益母草注射液作用于子宮平滑肌細(xì)胞呼吸鏈，維持線粒體的正常遞電子反應(yīng)和遞氫反應(yīng)，以生成子宮平滑肌細(xì)胞正常生理功能所必需的ATP。

在能量代謝過程中，細(xì)胞必須不斷合成ATP以維持能量代謝的正常進行，EPC中的ATP、AMP和ADP均為機體細(xì)胞代謝提供能量。機體能量代謝分為有氧代謝和無氧代謝2種途徑。在有氧代謝途徑中，ATP水解成AMP、ADP的同時釋放出自由能，參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)、核酸及核苷酸等的代謝。但在缺血或缺血再灌注后，組織器官均有不同程度的缺血或缺氧，此時有氧代謝途徑受阻，ATP、AMP、ADP合成降低，不能為細(xì)胞提供正?；顒拥哪芰浚瑹o氧代謝途徑被激活，ATP將依次降解ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤，并最終在體內(nèi)生成乳酸，釋放出的化學(xué)能為肌肉收縮提供能量。但無氧代謝途徑效率較低，生成的ATP、AMP、ADP減少，故TAN合成也降低，細(xì)胞因能量供給不足而出現(xiàn)代謝紊亂、并最終造成結(jié)構(gòu)破壞及功能異常[16-17]。因此，改善和保證EPC的正常代謝是糾正缺血再灌注損傷引起的能量代謝障礙、維持組織器官正常功能的前提。本實驗觀察到益母草組離體子宮平滑肌中ATP、AMP、ADP和TAN均較模型組明顯提高，提示益母草可促進組織能量代謝、增強組織供能，從而改善和糾正子宮缺血再灌注損傷引起的能量代謝障礙。

有研究表明，益母草可增強子宮收縮力[18-19]。肌肉收縮與Ca2+通道開放及Ca2+內(nèi)流有關(guān)，Ca2+內(nèi)流可增強肌肉收縮力。為進一步研究改善和糾正子宮缺血再灌注損傷后能量代謝障礙與子宮活動力的關(guān)系，本研究還觀察了不同灌流方法對缺血再灌注后離體子宮平滑肌活動力和Ca2+濃度的影響，發(fā)現(xiàn)益母草組離體子宮平滑肌收縮張力、收縮頻率和子宮活動力均明顯升高，但沒有恢復(fù)到假手術(shù)組水平，Ca2+濃度則明顯升高。提示益母草注射液可促使Ca2+通道開放并促進Ca2+內(nèi)流，而Ca2+內(nèi)流可增強肌肉收縮力。這進一步證實益母草注射液可能通過開放Ca2+通道而增強離體子宮平滑肌對益母草注射液的敏感性，并通過促進能量代謝而發(fā)揮對缺血再灌注子宮的保護作用。