李橋妹 黎冬明 洪艷平 鄭國(guó)棟

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

山茶油屬于山茶科油茶樹種子的提取物，是我國(guó)唯一能與西方橄欖油相媲美的高含油酸的特種油脂，被譽(yù)為“東方的橄欖油”[1]。山茶油具有良好的保健功能，不飽和脂肪酸可以有效預(yù)防冠心病、高血壓等心血管疾病，活性物質(zhì)、山茶皂素、茶多酚等分別具有強(qiáng)心、溶血栓及降低膽固醇等作用，甾醇、生育酚、角鱉烯等能增強(qiáng)兔疫功能，提高人體抗病能力，延緩人體衰老[2]。

山茶油在臨床應(yīng)用上具有較好的消炎作用，它不僅能解決幼兒因尿布引起的濕疹等皮膚疾病，也能用于皮膚輕度燒傷、燙傷等，具有很好的治療效果[3]。此外，山茶油還具有清熱抗炎、抗紫外線、抗菌等功效。

目前對(duì)山茶油抑菌機(jī)理的研究還鮮見相關(guān)報(bào)道，蔣艷玲等[4～5]比較了粗制茶油與精制茶油對(duì)各種微生物的抑菌效果，研究結(jié)果表明，無論粗制還是精制的山茶油在較低體積濃度都可抑制菌體生長(zhǎng)，而且抑菌作用受pH和溫度的影響較小，在pH4～9之間，茶油具有較好的抑菌效果，其抑菌作用在120 ℃的高溫下不受影響，充分說明山茶油抑制微生物的成分具有很高的穩(wěn)定性。

當(dāng)前，我國(guó)的茶油主要以食用為主，在醫(yī)療、食品和化妝領(lǐng)域均有廣闊的發(fā)展前景[6-8]。從目前對(duì)山茶油抑菌效果的研究可知，山茶油具有很好的抑菌作用，但是抑菌機(jī)理尚不明確。本研究以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為實(shí)驗(yàn)菌，對(duì)山茶油的抑菌機(jī)理進(jìn)行探討，皆在為山茶油的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

山茶油；牛血清白蛋白(BSA)；考馬斯亮藍(lán)G-2509；丙酮、95%乙醇、85%磷酸、NaCl：AR；大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。

1.1.2 主要儀器

V-5600型可見分光光度計(jì)；DDS-308+型智能電導(dǎo)率儀。

1.2 方法

1.2.1 丙酮的抑菌作用驗(yàn)證

移取10mL培養(yǎng)液于各試管中，加入0.2 mL菌懸液，加入0、0.6、1.2、1.56、1.68、1.74、1.764 mL丙酮，再加入相對(duì)應(yīng)體積的無菌生理鹽水，配制成總體積為12 mL的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測(cè)定各試管中OD600值。

1.2.2 山茶油最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參照呂淑霞等[9]對(duì)乳酸鏈球菌素(Nisin)抑菌作用及其抑菌機(jī)理的研究。移取10 mL培養(yǎng)液于試管中，加入0.2 mL菌懸液，加入相對(duì)應(yīng)體積的山茶油和丙酮，使其配制成一系列濃度的總體積為12 mL的混合液：10%、5%、2%、1%、0.5%、0.3%，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。陽性對(duì)照：僅含菌，不含山茶油和丙酮；陰性對(duì)照：不加菌懸液，為同一系列濃度的山茶油混合液。測(cè)定各試管中OD600值，與陰性對(duì)照管OD600值相同的最小山茶油濃度，即為最低抑菌濃度。

1.2.3 山茶油對(duì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

參照呂淑霞等[9]的研究。向培養(yǎng)液中加入菌懸液、山茶油、丙酮，配制成最低抑菌濃度的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，以不加山茶油與丙酮為對(duì)照組，每隔1 h取樣測(cè)定OD600值，平行測(cè)定3次，取平均值，繪制OD600值隨時(shí)間而變化的曲線。

1.2.4 堿性磷酸酶含量測(cè)定

參照周先漢等[10]對(duì)蜂膠提取物抑菌活性及其抑菌機(jī)理的研究。向培養(yǎng)液中加入菌懸液、山茶油、丙酮，配制成最低抑菌濃度的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，作用0、5、15、30、90、120、180 min后，取樣于510 nm下測(cè)吸光度，平行測(cè)定3次，取平均值，同時(shí)做不含山茶油與丙酮的對(duì)照，繪制OD510值隨時(shí)間而變化的曲線[12]。

1.2.5 電導(dǎo)率值測(cè)定

參照孫京新等[11]對(duì)茶多酚對(duì)假單胞菌抑菌機(jī)理研究。向培養(yǎng)液中加入菌懸液、山茶油、丙酮，配制成最低抑菌濃度的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，作用0、5、15、30、90、120、180 min后，從中移取一小部分，用于電導(dǎo)率的測(cè)定，同時(shí)測(cè)定不含山茶油與丙酮的對(duì)照，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，電導(dǎo)率值為縱坐標(biāo)，繪制變化曲線。

1.2.6 還原糖含量測(cè)定

向培養(yǎng)液中加入菌懸液、山茶油、丙酮，配制成最低抑菌濃度的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，作用1、2、3、4、5、6、17 h后，取1 mL待測(cè)液于試管中，將1 mL DNS溶液加入其中，在沸水中煮沸5 min后，取出，立即加入8 mL蒸餾水，使其快速降溫，于540 nm處測(cè)吸光值，平行測(cè)定，同時(shí)測(cè)定不含山茶油與丙酮的對(duì)照。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD540值轉(zhuǎn)換成相對(duì)應(yīng)的還原糖含量值，繪制還原糖含量隨時(shí)間而變化的曲線。

1.2.7 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照張赟彬等[12]荷葉精油對(duì)肉類食品中常見致病菌的抑菌機(jī)理研究及趙英永等[13]對(duì)考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量的研究進(jìn)行測(cè)定。向培養(yǎng)液中加入菌懸液、山茶油、丙酮，配制成最低抑菌濃度的混合液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量，于0、3、6、18、36 h取樣，于595 nm處測(cè)吸光度，同時(shí)設(shè)正常組對(duì)照[12～13]。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD540值轉(zhuǎn)換成相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量值，繪制出OD540值隨時(shí)間變化的曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酮的抑菌作用驗(yàn)證

比較加入一定體積丙酮的混合液吸光值與僅含菌懸液的吸光值，見表1。兩者之間相差較小，可得大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)繁殖受丙酮的影響較小。

表1 丙酮的抑菌性驗(yàn)證

注：“Ⅰ”代表含大腸桿菌的混合液吸光值，“Ⅱ”代表含金黃色葡萄球菌的混合液吸光值。

2.2 山茶油抑菌性能

2.2.1 山茶油最低抑菌濃度的測(cè)定

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為試驗(yàn)菌，通過測(cè)定各試管的OD600值，來判斷菌的生長(zhǎng)情況。由表2可知，當(dāng)山茶油濃度為10%、5%、2%、1%、0.5%時(shí)，含大腸桿菌的混合液吸光值與未加菌的山茶油混合液吸光值幾乎一致，即無菌生長(zhǎng)；而當(dāng)山茶油濃度降為0.3%時(shí)，含大腸桿菌的混合液吸光值劇增至1.244，由此可證明0.3%的山茶油濃度已經(jīng)不能抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)了，即有菌生長(zhǎng)，由此可說明能抑制大腸桿菌的最低山茶油濃度為0.5%，同理可知能抑制金黃色葡萄球菌的最低山茶油濃度為1%，由表3可知：山茶油對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

表2 不同濃度OD600值測(cè)定

注：Ⅰ代表山茶油混合液吸光值，Ⅱ代表含大腸桿菌的混合液吸光值，Ⅲ代表含金黃色葡萄球菌的混合液吸光值，—代表無此實(shí)驗(yàn)。

注：+代表有菌生長(zhǎng)，—代表無菌生長(zhǎng)，Ⅰ代表大腸桿菌生長(zhǎng)情況，Ⅱ代表金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)情況。

2.2.2 山茶油對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響

細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線可分為4個(gè)階段：延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。

由圖1可知，不加山茶油與丙酮的對(duì)照組，其生長(zhǎng)曲線呈較典型的“S”型；而實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)曲線則發(fā)生明顯變化，由此可知，山茶油在延滯期便對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌產(chǎn)生作用，從而抑制細(xì)菌的繁殖，使其生長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)為一條平緩線。

由實(shí)驗(yàn)組變化率可知，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組變化率更大，抑制效果更弱，從而表明山茶油對(duì)G+細(xì)菌的抑制效果弱于G-細(xì)菌，這可能是因?yàn)镚+細(xì)菌細(xì)胞壁厚度大，肽聚糖和磷壁酸的含量多，而G-細(xì)菌細(xì)胞壁厚度比G+細(xì)菌薄，肽聚糖層也很薄，故機(jī)械強(qiáng)度較G+細(xì)菌弱，山茶油更易對(duì)G-細(xì)菌起作用，即山茶油對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

圖1 山茶油對(duì)金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線的影響

2.3 山茶油抑菌機(jī)理

2.3.1 山茶油對(duì)堿性磷酸酶的影響

在細(xì)菌細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的間隙中存在著堿性磷酸酶，它在一般情況下不會(huì)外泄，當(dāng)細(xì)菌處于不利條件或受到抑菌劑的作用時(shí)，細(xì)胞壁通透性便增大，堿性磷酸酶便滲出[10]。通過在510 nm下測(cè)定堿性磷酸酶的含量，探究山茶油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的作用方式。

圖2 金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的堿性磷酸酶含量變化

由圖2可知，堿性磷酸酶含量的初始值不為0，這有可能是因?yàn)榫鷳乙褐写嬖诹呀馑劳龅木w，從而使堿性磷酸酶外泄，導(dǎo)致初始值不為0；未加山茶油與丙酮的對(duì)照組，其堿性磷酸酶含量無明顯變化，而加了山茶油與丙酮的實(shí)驗(yàn)組，其堿性磷酸酶含量先增加后趨于平緩。由此可證明，山茶油通過改變細(xì)胞壁的通透性，致使存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的堿性磷酸酶外泄，堿性磷酸酶含量上升；而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，堿性磷酸酶含量變化趨于平緩，這可能是因?yàn)樯讲栌团c細(xì)菌已作用完全，抑菌效果減弱，故后期堿性磷酸酶含量無明顯變化。

實(shí)驗(yàn)組變化率可知，大腸桿菌的堿性磷酸酶含量變化率更大，與本研究得出的山茶油對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌的結(jié)論相呼應(yīng)。

2.3.2 山茶油對(duì)電導(dǎo)率值的影響

細(xì)胞膜是維持細(xì)胞內(nèi)正常滲透壓的結(jié)構(gòu)屏障，能選擇性地控制細(xì)胞內(nèi)外營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)送，是包圍細(xì)胞質(zhì)的最佳“容器”。當(dāng)細(xì)菌受到不利影響時(shí)，細(xì)胞膜滲透性有所改變，細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)逸出，導(dǎo)致電導(dǎo)率值增大[14]。通過測(cè)定電導(dǎo)率的變化，來判斷山茶油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜滲透性的影響。

圖3 金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的電導(dǎo)率值變化

由圖3可知，未加山茶油與丙酮的對(duì)照組，其電導(dǎo)率值增長(zhǎng)趨勢(shì)較緩，說明對(duì)照組的細(xì)菌正常生長(zhǎng)，細(xì)胞膜滲透性良好；而加了山茶油與丙酮的實(shí)驗(yàn)組，其電導(dǎo)率值有明顯的增大，細(xì)胞內(nèi)容物滲出。由此可說明，山茶油可通過影響細(xì)胞膜的滲透性，使細(xì)胞內(nèi)小分子物質(zhì)逸出，影響細(xì)菌的正常生理功能，從而起到抑菌作用。

由實(shí)驗(yàn)組電導(dǎo)率的變化值可知，添加了山茶油溶液的大腸桿菌電導(dǎo)率值變化率更大，由此可知，山茶油對(duì)大腸桿菌的抑制效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

2.3.3 山茶油對(duì)還原糖的影響

用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定葡萄糖含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4，其線性方程為y=0.541 8x-0.032 6。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

將已測(cè)的大腸桿菌混合液及金黃色葡萄球菌混合液的還原糖吸光值通過線性方程進(jìn)行計(jì)算，由此可得還原糖含量隨時(shí)間的變化曲線，如圖5。

圖5 金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的還原糖變化曲線

由圖5可知，對(duì)照組還原糖含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)為先減小后趨于平穩(wěn)，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中存在還原糖，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖需要還原糖，因此還原糖含量先降低；而后期趨于平緩則有可能是因?yàn)檫€原糖已基本耗盡，利用率下降，或者是因?yàn)榧?xì)菌已達(dá)到衰亡期，利用還原糖能力下降[15]。

實(shí)驗(yàn)組還原糖的變化趨勢(shì)則為先減小后急劇增大最后減小，前期還原糖含量降低有可能是因?yàn)樯讲栌蛯?duì)細(xì)菌的作用還未影響細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞內(nèi)容物包括糖類未泄出，細(xì)菌正常地利用培養(yǎng)基中的還原糖進(jìn)行生長(zhǎng)，因此還原糖含量降低；而后急劇增大則可能是因?yàn)樯讲栌鸵延绊懠?xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄出，因此還原糖含量增大；最后還原糖含量降低，可能是因?yàn)樯讲栌蛯?duì)細(xì)菌的影響已作用完全，存活的細(xì)菌繼續(xù)利用培養(yǎng)基中的還原糖生長(zhǎng)繁殖。

2.3.4 山茶油對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響

用牛血清白蛋白測(cè)定蛋白質(zhì)含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6，其線性方程為y=1.61x+2.420 6。

圖6 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

將已測(cè)的大腸桿菌混合液及金黃色葡萄球菌混合液的蛋白質(zhì)吸光值通過線性方程進(jìn)行計(jì)算，由此可得蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間的變化曲線，如圖7。

圖7 金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的蛋白質(zhì)變化曲線

由圖7可知，對(duì)照組蛋白質(zhì)含量變化曲線呈先下降平緩的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)需要氮源，牛肉膏和蛋白胨為細(xì)菌繁殖提供氮源，因此對(duì)照組中蛋白質(zhì)含量先下降，后期呈漸緩的趨勢(shì)則可能是因?yàn)榕Ｈ飧嗪偷鞍纂撕恳褞缀鹾谋M，或者是因?yàn)榧?xì)菌的生長(zhǎng)已達(dá)到衰亡期，消耗蛋白質(zhì)的能力下降[16]。

而實(shí)驗(yàn)組中蛋白質(zhì)含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這有可能是因?yàn)榧?xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)容物包括蛋白質(zhì)泄出，由此可知：山茶油通過破壞細(xì)胞膜的完整性，來起到抑菌作用。由實(shí)驗(yàn)組變化率可知，大腸桿菌蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)趨勢(shì)強(qiáng)于金黃色葡萄球菌，即山茶油對(duì)大腸桿菌的抑菌效果強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。

3 結(jié)論

山茶油具有較好的抑菌效果。山茶油對(duì)細(xì)菌的作用始于延滯期，其對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.5%、1%，對(duì)G-的抑制效果強(qiáng)于G+。

由堿性磷酸酶含量、電導(dǎo)率值、還原糖含量以及蛋白質(zhì)含量變化，可知山茶油的抑菌機(jī)理主要是通過影響細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性甚至破壞細(xì)胞膜的完整性來達(dá)到抑菌作用。