郭 楠，吳 莉

卵巢低反應(yīng)是指在控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation, COH)過程中卵巢對促性腺激素(gonadotropins, Gn)反應(yīng)過低甚至無反應(yīng)，導(dǎo)致獲卵數(shù)少、周期取消率高以及臨床妊娠率降低。卵巢低反應(yīng)會在一定程度上危害患者的生殖健康，已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中最具挑戰(zhàn)性的難題之一。卵巢低反應(yīng)受多種因素影響，除了年齡以外，通常認為卵巢反應(yīng)性的好壞主要取決于卵巢儲備情況[1]。而越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，相當(dāng)一部分年輕、卵巢儲備功能良好的婦女也會發(fā)生低反應(yīng)。近年來，部分研究認為卵巢反應(yīng)與體內(nèi)的免疫微態(tài)有關(guān)，而25-羥基維生素D(25-OH-VD)、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、免疫細胞亞群(T細胞、B細胞、NK細胞)均是參與機體免疫的重要指標。該研究旨在探討卵巢反應(yīng)性與25-OH-VD、Hcy及T細胞、B細胞、NK細胞的關(guān)系，為臨床上對于卵巢低反應(yīng)的診斷和治療提供可靠的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基礎(chǔ)資料選取2017年9月～2018年2月在安徽省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(invitrofertilization or intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,IVF/ICSI-ET)治療的179例患者作為觀察對象，根據(jù)獲卵數(shù)目分為2組，其中將獲卵數(shù)≤3個的61例患者作為卵巢低反應(yīng)組，將獲卵數(shù)在4～18個的118例患者作為正常反應(yīng)組[2]。兩組患者的年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、竇卵泡數(shù)(antral follicle count,AFC)、基礎(chǔ)促卵泡生長激素(basic follicle-stimulating hormon,bFSH)、基礎(chǔ)黃體生成素(basic luteinizing hormone,bLH)、基礎(chǔ)雌二醇(basic estradiol,bE2)等指標比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者的臨床基礎(chǔ)資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1納入標準 年齡≤35歲；卵巢儲備功能正常；單純因輸卵管因素或男方因素行IVF-ET/ICSI-ET者；本人或家屬知情并簽署同意書。

1.2.2排除標準 既往多囊卵巢綜合征；存在卵巢反應(yīng)不良高危因素者；合并子宮內(nèi)膜異位癥或其他內(nèi)分泌疾?。患韧涣既焉锸?；中途退出研究者。

1.3 方法

1.3.1控制性超促排卵 全部入組研究對象均采用經(jīng)典黃體期降調(diào)節(jié)長方案，方法如下：月經(jīng)周期第2～4天開始口服避孕藥(炔雌醇環(huán)丙孕酮片，商品名達英-35，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)1片/次，每天1次，口服用藥21 d，在服用第14～17天時采用超聲檢查有無大卵泡，如無大卵泡，即日開始皮下注射促性腺激素釋放激素激動劑醋酸亮丙瑞林微球(批準文號：國藥準字H20093852；生產(chǎn)單位：上海麗珠制藥有限公司；藥品規(guī)格：3.75 mg)，根據(jù)患者BMI值，調(diào)整降調(diào)藥物劑量1.250～1.875 mg，待14 d后抽血檢測促卵泡生長激素(follicle-stimulating hormon,FSH)、黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、雌二醇(estradiol,E2)同時陰道超聲檢查卵泡情況，適時加用促性腺激素(批準文號：國藥準字H20052130；生產(chǎn)單位：麗珠集團麗珠制藥廠；藥品規(guī)格：以尿促卵泡素效價計75 IU)150～300 IU，當(dāng)至少有一個卵泡直徑達18 mm以上或至少有兩個卵泡直徑達17 mm時，注射重組人絨促性腺素(注冊證號：S20110045；生產(chǎn)單位：Merck Serono Europe Limited；藥品規(guī)格：250 μg)250 μg。36 h后在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵。

1.3.2標本收集 ① 在IVF治療前一個月經(jīng)周期第2～5天清晨留取患者空腹靜脈血5 ml，用來檢測FSH、LH、E2、25-OH-VD、Hcy等指標；② 在GnRHa降調(diào)節(jié)后14 d，再次空腹來院留取靜脈血3 ml，檢測FSH、LH、E2等指標；③ 注射重組人絨促性腺素日抽取空腹靜脈血3 ml，檢測免疫細胞亞群。

1.3.3標本檢測 ① 采用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測FSH、LH、E2水平，ACCESS全自動微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)購自美國Beckman公司；② 采用ELISA法檢測Hcy水平，試劑盒及相關(guān)配套檢測試劑均購自北京百奧萊博科技有限公司；③ 采用ELISA法檢測25-OH-VD水平，試劑盒及相關(guān)配套檢測試劑均購自美國R&D公司；④ 采用FACSCalibur 流式細胞儀檢測T、B、NK細胞亞群，流式細胞儀及相關(guān)的配套檢測設(shè)備均購自美國BD公司。全部數(shù)據(jù)均取平均值，剔除異常數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的降調(diào)結(jié)果比較兩組患者降調(diào)后的FSH、LH、E2、子宮內(nèi)膜厚度、竇卵泡直徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.2 兩組的促排天數(shù)、促排用量、Hcy、25-OH-VD表達水平比較卵巢低反應(yīng)組中Hcy水平均高于正常反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但兩組的促排天數(shù)、促排用量、25-OH-VD水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 兩組患者的降調(diào)結(jié)果比較

表3 兩組患者的Hcy、25-OH-VD水平、促排天數(shù)比較

2.3 兩組患者免疫細胞亞群表達情況比較卵巢低反應(yīng)組中T細胞、Th細胞水平均稍高于正常反應(yīng)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NK細胞比例顯著高于正常反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組患者的免疫細胞亞群表達情況比較

3 討論

3.1 卵巢激素、子宮內(nèi)膜厚度、竇卵泡直徑的檢測意義COH是體外受精胚胎移植技術(shù)的重要組成部分，該療法可增加在同一周期的卵泡募集，避免機體內(nèi)在的選擇單個卵泡的機制以及主導(dǎo)卵泡對其他卵泡生長發(fā)育的抑制作用，從而使多個卵泡同步生長發(fā)育并達到成熟，提高同一周期的獲卵數(shù)，進而提高妊娠率。由于不同患者的卵巢對Gn的敏感度不同，因此藥物的療效存在一定的差異性。臨床上準確預(yù)測卵巢反應(yīng)性，有助于降低周期取消率及減少相關(guān)醫(yī)源性并發(fā)癥，但卵巢高反應(yīng)的高低目前尚無統(tǒng)一標準，其中FSH、LH、E2、子宮內(nèi)膜厚度、竇卵泡直徑等指標均是預(yù)測卵巢反應(yīng)性的重要指標，而本研究中兩組患者降調(diào)后的FSH、LH、E2、子宮內(nèi)膜厚度、竇卵泡直徑比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，導(dǎo)致上述結(jié)果可能與患者的年齡有關(guān)，國內(nèi)學(xué)者李麗娟 等[3]的臨床研究中證實，年齡超過35歲患者中血FSH、LH等指標對卵巢低反應(yīng)有較好預(yù)測價值，而在年齡低于35歲患者中則無預(yù)測價值。

3.2 25-OH-VD、Hcy與卵巢反應(yīng)性

3.2.125-OH-VD與卵巢反應(yīng)性 近年來，隨著生殖領(lǐng)域研究的不斷深入，維生素D在生殖領(lǐng)域中引起了越來越廣泛的關(guān)注。國外的一項研究指出維生素D可參與鈣磷代謝、機體免疫及生殖等生理過程，是生殖過程中的一個關(guān)鍵因素[4]。25-OH-VD是維生素D在機體內(nèi)的主要循環(huán)形態(tài)，主要是由維生素D在肝臟中通過羥基化作用轉(zhuǎn)化而來，是目前公認的能夠客觀評價維生素D營養(yǎng)狀況的最佳指標。維生素D參與生殖過程可能與以下幾方面因素有關(guān)：25-OH-VD可在腎臟中轉(zhuǎn)化為具有活性的1,25(OH)2D3，卵巢是1,25(OH)2D3的靶器官，因此維生素D3活性代謝產(chǎn)物可能在調(diào)節(jié)卵巢活動中發(fā)揮重要作用；另有文獻[5]報道，人抗穆勒管激素(AMH)基因啟動子區(qū)存在一種功能性的維生素D反應(yīng)素，直接影響AMH的表達，而1,25(OH)2D3可改變顆粒細胞對AMH的敏感性，促進顆粒細胞的分化與發(fā)育。這一理論與Irani et al[6]提出的維生素D可以下調(diào)AMH基因的表達，上調(diào)促卵泡激素受體基因的表達相符。結(jié)果提示維生素D水平可能影響著卵泡發(fā)育和卵巢的反應(yīng)性。同時有研究[7]結(jié)果表明，白種人維生素D水平和IVF結(jié)局呈正相關(guān)，然而在亞洲人群中并未觀察到這種現(xiàn)象。本結(jié)果也顯示25-OH-VD水平在卵巢低反應(yīng)組與正常反應(yīng)組無顯著差異。

3.2.2Hcy與卵巢反應(yīng)性 Hcy是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中的重要中間產(chǎn)物，近些年國內(nèi)外一些研究[8]表明，體內(nèi)Hcy水平升高會對男性和女性的生育力產(chǎn)生一定的影響。本研究結(jié)果顯示，卵巢低反應(yīng)組中Hcy水平均高于正常反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Hcy可能與卵巢低反應(yīng)有關(guān)。Hcy對卵巢低反應(yīng)的影響機制目前尚不十分明確，但大量的研究[9-10]顯示基因的多態(tài)性可能會影響Hcy的表達，而Hcy的高表達可能通過減少細胞分裂、產(chǎn)生相關(guān)的炎性細胞因子而導(dǎo)致卵泡發(fā)育、胚胎發(fā)育、激素分泌等生殖功能受損。

3.3 T細胞、B細胞、NK細胞與卵巢反應(yīng)性在IVF周期中，為了募集到更多的卵泡而使用大量的外源性Gn，會引起雌二醇及其他激素處于高生理水平狀態(tài)，免疫微環(huán)境也隨之改變。一般認為Gn刺激可改變卵泡液中免疫細胞形態(tài)及卵泡液和外周血中免疫細胞比例，改變患者機體內(nèi)的免疫狀態(tài)。研究[11-12]顯示μNK細胞可分泌血管內(nèi)皮生長因子、趨化因子-10、白細胞介素-8、基質(zhì)細胞衍生因子-1等多種促血管生成因子，調(diào)節(jié)血管發(fā)生。血管發(fā)生的調(diào)節(jié)在女性生殖生理中扮演著重要的角色，可影響卵泡的生長、優(yōu)勢卵泡及黃體的形成、子宮內(nèi)膜的分化及胚胎的植入等重要的生理過程，是誘發(fā)卵巢低反應(yīng)的高危因素。Jimmy et al[13]的相關(guān)臨床研究中顯示，在卵巢血流顯示欠佳的患者中，至少36%的患者表現(xiàn)出了卵巢低反應(yīng)，僅有16%的患者表現(xiàn)為正常的卵巢反應(yīng)。另有研究[14]證實，在反復(fù)種植失敗的患者中外周血pNK細胞比例增加，pNK呈活化狀態(tài)，細胞毒性增強。本研究中，兩組T細胞與B細胞比例間存在差異但無統(tǒng)計學(xué)意義，而NK細胞比例的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，推測NK細胞或許可通過調(diào)控卵巢周圍血管的生成及改變卵巢周圍的免疫微環(huán)境，通過產(chǎn)生細胞毒性來影響卵巢反應(yīng)，造成卵巢反應(yīng)不良。

綜上所述，Hcy、NK細胞與卵巢反應(yīng)性存在密切的相關(guān)性，二者的高表達或可引起卵巢低反應(yīng)，進而影響生殖健康。當(dāng)然本研究也存在一定的局限性，由于研究時間有限，加上卵巢低反應(yīng)組內(nèi)患者的病例數(shù)較少，因此試驗結(jié)果可能存在一定偏差，今后逐步完善試驗方案，擴大試驗規(guī)模，進一步探討血清25-OH-VD、Hcy和免疫細胞水平與卵巢反應(yīng)性的相關(guān)性，為臨床治療提供參考依據(jù)。