高婉卿，鄭必霞，楊 勁，李凌波，孫喜東

新生兒溶血病(hemolytic disease of newborn，HDN)是新生兒期最為常見(jiàn)的疾病之一，主要包括ABO溶血和Rh溶血兩大類(lèi)，前者約占85.8%，Rh溶血約占14.2%[1]。而臨床中Rh-HDN較ABO溶血起病急，病情重，溶血程度重，病情發(fā)展迅速，患兒可在生后24 h內(nèi)出現(xiàn)黃疸，并呈進(jìn)行性加重，同時(shí)可有程度的貧血、心力衰竭和呼吸窘迫等，重者可導(dǎo)致核黃疸并造成核黃疸后遺癥，嚴(yán)重影響患兒的生命健康[2-3]。因此，提高產(chǎn)前Rh-HDN診斷率，并積極進(jìn)行產(chǎn)前預(yù)防和產(chǎn)后的及時(shí)治療是降低患兒死亡率、致殘率的關(guān)鍵。該研究對(duì)64例Rh-HDN患兒的血型進(jìn)行篩選、鑒定，檢測(cè)患兒IgG抗體亞型，并分析Rh-HDN與患兒不同IgG亞型的相關(guān)性以及不同制備抗體對(duì)Rh-HDN的影響，旨在為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究病例均來(lái)自2014年6月～2018年6月合肥市第二人民醫(yī)院兒科及南京市兒童醫(yī)院收治的64例Rh-HDN患兒，患兒母親產(chǎn)前抗體鑒定確定為Rh系統(tǒng)同種抗體。治療納入標(biāo)準(zhǔn)：① 患兒與母親Rh血型不符；② 患兒出生后24 h內(nèi)出現(xiàn)黃疸，并呈進(jìn)行性加重；③ Coombs試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)中至少一項(xiàng)為陽(yáng)性；④ 均為單胎患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 診斷為ABO溶血的患兒；② 患兒合并先天性疾病；③ 合并心、肝、腎等實(shí)質(zhì)性器官病變的患兒；④ 合并凝血功能障礙的患兒。64例患兒中，男38例，女26例；平均體質(zhì)量(3.52±1.36 )kg；入院時(shí)間產(chǎn)后3～76 h，平均日齡1.6 d；自然分娩35例，剖宮產(chǎn)29例；母親妊娠次數(shù)≤1次16例，>1次48例。本研究經(jīng)合肥市第二人民醫(yī)院及南京市兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞、抗-C、抗-e、抗-E、抗-e、抗-IgG1、抗-IgG2、抗-IgG3、抗-IgG4均購(gòu)自Sanquin公司；抗-D、Rh分型卡、LISS-Coombs卡、空白微柱凝膠卡均購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1Rh系統(tǒng)抗體檢測(cè) 將準(zhǔn)備好的不規(guī)則抗體篩檢卡做好標(biāo)記，將配好的篩檢細(xì)胞或譜細(xì)胞懸液加入標(biāo)好的微管中，各1滴(或50 μl)，并立即分別加入待測(cè)血清1滴(或50 μl)；將加樣后的試劑卡在專(zhuān)用37 ℃孵育箱中孵育15 min；使用專(zhuān)用離心機(jī)離心5 min(900 r/min，2 min；1 500 r/min，3 min)，取出直接肉眼觀察結(jié)果。所有操作均嚴(yán)格按照儀器與試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2直接Coombs試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn) 將患兒壓積紅細(xì)胞與適量紅細(xì)胞稀釋液混合配制成0.8%～1%的紅細(xì)胞懸液，采取患兒外周靜脈血置于無(wú)抗凝劑試管中，并于37 ℃下放置2 h，2 000 r/min離心10 min，取上清液(該上清液不得有絮狀物或沉淀)。充分洗滌紅細(xì)胞至少3次，取同體積洗滌后的壓積血和6%牛血清白蛋白(或生理鹽水)混勻，置于56 ℃孵育10 min，期間不斷搖動(dòng)，1 000 r/min離心2～3 min，取上清液，即放散液。直接Coombs試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3.3IgG亞型檢測(cè) 將IgG 1、2、3、4抗體加入到空白LISS-Coombs卡中，按直接Coombs試驗(yàn)方法檢測(cè)患兒紅細(xì)胞上包被的相應(yīng)IgG亞型。所有操作均嚴(yán)格按照儀器與試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4血清膽紅素檢測(cè) 患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平采用貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。所有操作均嚴(yán)格按照儀器與試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)① 患兒母親Rh系統(tǒng)抗體篩查、鑒定以及患兒紅細(xì)胞IgG抗體亞型檢測(cè)結(jié)果；② 患兒直接Coombs試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)結(jié)果；③ 不同Rh系統(tǒng)抗體組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平。

1.5 診斷標(biāo)準(zhǔn)Rh-HDN診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：① 母嬰Rh血型不合；② 新生兒出生后24 h內(nèi)出現(xiàn)黃疸，并呈進(jìn)行性加重；③ 新生兒溶血3項(xiàng)試驗(yàn)即直接Coombs試驗(yàn)、游離抗體檢測(cè)、抗體釋放試驗(yàn)中至少一項(xiàng)為陽(yáng)性。

微柱凝膠法測(cè)定Rh系統(tǒng)抗體效價(jià)較傳統(tǒng)方法(聚凝胺法、抗人球蛋白試管法)高出1～2個(gè)滴度，故抗體效價(jià)≥32時(shí)評(píng)價(jià)為有臨床意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒母親Rh系統(tǒng)抗體篩查、鑒定以及患兒紅細(xì)胞IgG抗體亞型檢測(cè)結(jié)果Rh系統(tǒng)D、C、c、E、c 5種抗原對(duì)應(yīng)的抗體均可導(dǎo)致新生兒Rh-HDN發(fā)病，以抗-D和抗-E最為常見(jiàn)，引起新生兒Rh-HDN發(fā)病的IgG抗體亞型主要包括IgG1(23例，35.94%)、IgG1、3(35例，54.68%)，另外，有2例患兒同時(shí)存在IgG1～3，1例同時(shí)存在IgG1～4，表明IgG2、IgG4也能通過(guò)胎盤(pán)并包被胎兒紅細(xì)胞，見(jiàn)表1。

2.2 患兒直接Coombs試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)結(jié)果患兒直接Coombs試驗(yàn)結(jié)果：均為陽(yáng)性；患兒游離抗體試驗(yàn)結(jié)果：4例為陽(yáng)性-/+，6例為陽(yáng)性1+，33例為陽(yáng)性2+，21例為陽(yáng)性3+。

2.3 患兒不同IgG抗體亞型與其血清總膽紅素、間接膽紅素水平相關(guān)性分析IgG1、3組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素平均水平明顯高于IgG1或IgG3組(P<0.05)；分別以患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平作為因變量，以患兒不同IgG抗體亞型水平作為自變量行Pearson相關(guān)性分析，患兒IgG1水平與患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；患兒IgG3水平與患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；患兒IgG1、3水平與患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；見(jiàn)表2、3。

2.4 不同Rh系統(tǒng)抗體組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平比較抗-D組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素平均水平明顯高于非抗-D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

3 討論

在HDN發(fā)病過(guò)程中，IgG抗體發(fā)揮了關(guān)鍵作用。IgG是人體免疫球蛋白之一，主要由脾、淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成和分泌，以單體形式存在，是血清主要的抗體成分，約占血清Ig的75%，其中40%～50%分布于血清中，其余分布在組織中[4-5]。根據(jù)IgG分子中的r鏈抗原性差異，人IgG有四個(gè)亞型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，在血清中濃度IgG1>IgG2>IgG3>IgG4[6]。IgG在人體抗感染免疫尤其是再次免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，包括激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，介導(dǎo)溶菌和細(xì)胞毒作用；介導(dǎo)ADCC效應(yīng)；結(jié)合SPA；中和毒素和病毒等[7-8]。另外，IgG是唯一可以通過(guò)胎盤(pán)的免疫球蛋白，是胎兒免疫的重要組成部分。出生前，胎兒IgG主要來(lái)自母體，在孕前期22～28周間，胎兒血IgG濃度與母體血IgG濃度相等，出生后母體IgG逐漸減少，到第3、4月胎兒血IgG降至最低，隨后胎兒逐漸開(kāi)始合成IgG，血清IgG逐漸增加[9]。在HDN發(fā)病中，由于母體內(nèi)產(chǎn)生了大量針對(duì)胎兒血型的IgG抗體，通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，并與胎兒紅細(xì)胞表面抗原相結(jié)合，導(dǎo)致胎兒紅細(xì)胞被吞噬、破裂，最終引起HDN。因此，分析不同IgG亞型與Rh血型系統(tǒng)新生兒溶血病的關(guān)系，檢測(cè)Rh系統(tǒng)致病抗體，對(duì)預(yù)防和治療Rh-HDN具有重要臨床意義。

表1 患兒母親Rh系統(tǒng)抗體篩查、鑒定以及患兒紅細(xì)胞IgG抗體亞型檢測(cè)[n(%)]

表2 不同IgG抗體亞型組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平比較

表3 患兒不同IgG抗體亞型與其血清總膽紅素、間接膽紅素水平相關(guān)性分析

表4 不同Rh系統(tǒng)抗體組患兒血清總膽紅素、間接膽紅素水平比較

本研究就Rh血型系統(tǒng)新生兒溶血病與IgG1、IgG3的相關(guān)性及其致病抗體展開(kāi)研究，結(jié)果顯示：IgG1與IgG1、3血型抗體是引起Rh-HDN最主要的IgG亞型，而IgG3單獨(dú)存在時(shí)較少引起Rh-HDN。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析顯示： Rh-HDN的病情與患兒IgG水平呈明顯正相關(guān)，患兒IgG1與IgG1、3水平越高，其血清總膽紅素和間接膽紅素水平越高，病情越嚴(yán)重。國(guó)外報(bào)道1 ∶32 的抗體效價(jià)是胎兒溶血病嚴(yán)重程度的臨界值，當(dāng)母親IgG抗體效價(jià)> 1 ∶32 時(shí)，需高度關(guān)注并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)胎兒溶血狀況。本研究64例Rh-HDN患兒，出生時(shí)IgG抗體效價(jià)大多>1 ∶32，大部分患兒表現(xiàn)為中度以上溶血，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道形似。本研究24例患兒發(fā)生了宮內(nèi)溶血，其IgG抗-D抗體效價(jià)平均>1 ∶1 024，但值得注意的是1例患兒IgG 抗-D抗體效價(jià)達(dá)1∶1 024但并沒(méi)有發(fā)生宮內(nèi)溶血，且出生時(shí)Apgar 評(píng)分為10分，可能是患兒母親多次妊娠后，體內(nèi)產(chǎn)生抗HLA抗體，阻止單核細(xì)胞與抗-D抗體致敏紅細(xì)胞之間的結(jié)合，即母源性HLA抗體封閉了胎兒巨噬細(xì)胞的Fc受體，阻止了胎兒致敏紅細(xì)胞的破壞。而當(dāng)胎兒出生后，失去了母體HLA抗體的保護(hù)，高效價(jià)抗-D抗體使胎兒迅速發(fā)生嚴(yán)重的HDN。母親Rh血型系統(tǒng)篩選、鑒定結(jié)果顯示：導(dǎo)致新生兒Rh-HDN發(fā)病Rh系統(tǒng)血型抗體包括抗-D、抗-CD、抗-DE、抗-E、抗-cE、抗-C 、抗-Ce 抗-c、抗-e等，但主要以抗-D和抗-E為主要致病抗體，本研究中，抗-D占34.15%，抗-E占28.05%，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符。通過(guò)對(duì)比不同Rh系統(tǒng)血型抗體患兒血清膽紅素水平發(fā)現(xiàn)，抗-D較其他Rh抗體引起的HDN嚴(yán)重，有研究顯示，Rh血型系統(tǒng)多重抗體比單一抗體更易引起HDN，且癥狀更嚴(yán)重。目前，國(guó)外學(xué)者認(rèn)為Rh抗體效價(jià)≥16有較大的臨床意義，本研究采用微柱凝膠法與傳統(tǒng)方法相比高出1～2個(gè)滴度，因此以Rh抗體效價(jià)≥32判斷臨界值。但本研究認(rèn)為不論Rh抗體效價(jià)高低，只要母親體內(nèi)存在此抗體，特別是含有抗-D類(lèi)的Rh抗體，臨床都應(yīng)警惕HDN的發(fā)生，如抗體效價(jià)伴隨妊娠周齡的增加而不斷升高，臨床上應(yīng)高度重視，產(chǎn)后嬰兒應(yīng)立即做HDN血清學(xué)檢測(cè)，病情嚴(yán)重者應(yīng)及早進(jìn)行換血治療。

綜上所述，在Rh-HDN的臨床預(yù)防和診斷中，不僅要加強(qiáng)對(duì)RhD抗原的檢測(cè)，同時(shí)也不能忽略Rh其他類(lèi)型抗原的檢查的重要性，特別是對(duì)抗-E和抗-cE的檢測(cè)。Rh血型系統(tǒng)抗體主要是IgG抗體，其中以IgG1和IgG1、3為主，并且Rh-HDN病情與IgG1和IgG1、3水平呈明顯正相關(guān)關(guān)系，因此，臨床應(yīng)積極對(duì)產(chǎn)前孕婦體內(nèi)IgG1、IgG3水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。另外，胎兒出生后，及時(shí)檢測(cè)其IgG1、IgG3水平，有利于準(zhǔn)確評(píng)估患兒病情，為患兒的治療方案選擇提供指導(dǎo)。