余鵬，楊雨陽，謝德高，高漓，滕若冰

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院 1.泌尿外科；2.生殖男科，廣西 桂林 541000）

不孕不育是臨床較為常見的一種疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization,WHO）調查，15%育齡夫婦存在不育問題，而發(fā)展中國家某些地區(qū)可高達30%，男女雙方原因各占50%[1-2]。影響男性不育的因素有很多，包括內分泌因素、遺傳因素和環(huán)境等因素，但目前全球只有25%～40%患者能查明病因并予以對癥治療，不能查明病因的臨床上稱之為特發(fā)性男性不育，但傾向考慮與環(huán)境或遺傳因素相關，基因突變是一個很重要的遺傳因素。臨床上對不育男性進行精液分析常提示少精子癥、畸形精子癥和無精子癥，因此對精子的發(fā)生以及影響精子發(fā)生的因素的研究成為了近幾年研究的熱點。細胞色素P4501A1（cytochrome P450 1A1,CYP1A1）是一種重要的解毒酶，它由CYP1A1基因編碼，CYP1A1基因位于染色體15q22-15q24，含7個外顯子和6個內含子，總長5 810 bp。目前有大量的研究報道了CYP1A1在多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）的代謝中能產生一種生物活性中間體，而這種活性中間體對男性生殖有潛在的毒性[3-4]。CYP1A1基因本身存在結構變異即多型性，目前已發(fā)現(xiàn)4個重要的多型性位點，分別稱m1、m2、m3和m4。m1是3'-端T6235C點突變。m2是第七外顯子A4889G突變，m2與m1位點突變高度關聯(lián)。m3位于第七內含子，為T＞C轉換突變，m4是與m2相鄰的C＞A顛換突變。這些研究中報道最多的是m3，即T＞C轉換突變（或4646903基因位點突變），其特征在于CYP1A1基因的39個側翼區(qū)域中核苷酸3801處的T至C突變。3801T＞C多態(tài)性可以改變基因表達水平或信使RNA穩(wěn)定性，從而可高度誘導酶的表達及其活性[5-6]。進而改變雌激素受體α和芳烴受體的表達水平，導致男性生殖功能障礙。除此之外，CYP1A1 T3801C多態(tài)性和雌激素的相互作用將會損傷精子的發(fā)生，最終導致男性不育[7]。到目前為止，有很多文獻報道了CYP1A1基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關性研究，然而，他們報道的結果卻不盡相同，而且最近的一次meta分析卻是在2014年，納入的文獻數(shù)量較少，近幾年又有新的相關文獻報道，有必要對文獻再次進行系統(tǒng)評價和薈萃分析來評估CYP1A1 T3801 C多態(tài)性與男性特發(fā)性不育易感性之間的關聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索

本系統(tǒng)評價和meta分析遵循系統(tǒng)評價和meta分析報告首選報告項目（preferred reporting items for systematic reviews and meta-analysis,PRISMA）指南。檢索數(shù)據(jù)庫包括：英文數(shù)據(jù)庫Pubmed、Medline、Embase和中文數(shù)據(jù)庫中國知網(wǎng)。英文檢索詞：“Cytochrome P450 CYP1A1”、“EROD”、“Ethoxyresorufin Dealkylase”、“Ethylresorufin O-Deethylase”、“CYP1A1 Protein”、“7-Ethoxyresorufin O-Deethylase”、“Cytochrome P4501A1”、“Ethoxyresorufin O-Deethylase”、“CYP1A1”、“Polymorphisms，Genetic”、“Genetic Polymorphisms”、“Genetic Polymorphism”、“Polymorphism (Genetics)”、“Polymorphisms(Genetics)”、“SNP”、“Single nucleotide polymorphism”、“Male Infertility”、“Sterility，Male”、“Male Sterility”、“Subfertility,Male”、“Male Subfertility”、“Sub-Fertility,Male”、“Male Sub-Fertility”、“Subfertility,male”、“Azoospermia”、“Oligozoospermia”及“Malformed sperm”。中文檢索詞：細胞色素P4501A1、CYP1A1、基因多態(tài)性、基因融合、基因突變、男性不育、無精子癥、少精子癥、弱精子癥及精子畸形。檢索語言不受限制。檢索時間：自建庫以來至2018年8月31日。為盡量避免查漏文獻，采取電腦檢索和手工檢索相結合的方法，并對所檢索的文獻的參考文獻進行二次檢索。

1.2 文獻納入和排除標準

1.2.1 文獻納入標準 ①病例對照研究；②病例組和對照組中有rs4646903基因型的分布；③包含了rs4646903基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的評價；④對照組有哈代溫伯格定律檢驗；⑤能獲取全文。

1.2.2 排除標準 ①重復報告、質量差的文獻；②無基因型分布或基因型分布不完整的文獻；③對照組未進行哈代溫伯格定律檢驗的文獻；④各種評價類、綜述類文獻；⑤僅有摘要，無全文的文獻。

1.3 數(shù)據(jù)提取

根據(jù)以上的納入和排除標準，由兩位研究人員獨立評估以確定納入文獻，并對納入的文獻獨立提取數(shù)據(jù)，對于有爭議的文獻會對摘要進行檢測，必要時檢查全文。確定納入文獻后，兩位研究人員獨立地對每個研究提取數(shù)據(jù)，提取的信息包括：第一作者的姓名、出版年份、國家、人種以及病例組和對照組人群中基因型頻率的分布。所納入的文獻人群分為亞洲人群和高加索人群。值得注意的是，由于歷史和地理的原因，伊朗處于高加索人民向地中海運動的路線上，伊朗應該是歐洲人的后裔，根據(jù)以往發(fā)表的文獻，伊朗和印度人被歸類于高加索人群[8]，在本次研究中，也將印度和伊朗人歸類為高加索人群進行分層分析。

1.4 質量評價

通過紐卡斯爾-渥太華量表（the Newcastle-Ottawa Scale,NOS）來評估所納入的每項研究，其中包含三大塊共8個條目專門評價病例對照研究[9]。主要從以下三個方面來評價：病例組與對照組選擇方法、病例組與對照組的可比性、接觸暴露評估方法。評價后星數(shù)（☆）越多質量越好。由兩位評審人員獨立地評估納入的每項研究，并通過討論解決他們評估過程中的任何分歧?？紤]到最初文獻檢索中發(fā)現(xiàn)的病例對照研究的質量存在差異，如果所納入文獻NOS評分均≥6顆星，認為研究質量很高[10]。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用stata 12.0軟件對CYP1A1基因rs4646903位點與特發(fā)性男性不育的關系進行統(tǒng)計學分析。首先對納入的各項研究綜合采用Q檢驗和I2值進行異質性檢驗。如果Q檢驗的P值大于0.1或I2＜50%，說明各研究間無顯著統(tǒng)計學異質性，所以應采用固定效應模型進行合并分析，反之，則用隨機效應模型進行合并分析。為了探究異質性的來源，需要根據(jù)所納入研究的一些相似性特征，諸如種族、樣本量來進行亞組分析，并通過省略每一個單項研究來進行靈敏度分析，以反映個體數(shù)據(jù)集對合并后的OR值的影響。使用“genhwcci”STATA命令進行適當?shù)腃hisquare擬合優(yōu)度檢驗[11]，以評估在對照組中與哈迪·溫伯格平衡定律（Hardy-Weinberg equilibrium,HWE）的偏差。用合并后的OR值和95%可信區(qū)間（confidence index,CI）來描述CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的關系，分別檢測CYP1A1基因rs4646903位點的五個基因模型：等位基因模型（C vs.T）、純合子模型（CC vs.TT）、雜合子模型（CT vs.TT）、顯性模型（CC+CT vs.TT）以及隱形模型（CC vs.CT+TT），并繪制OR值森林圖。最后通過Begger's和Egger's的不對稱測試[12]來評價發(fā)表偏倚，解釋Egger檢驗的統(tǒng)計學顯著性定義為P＜0.05。

2 結果

2.1 檢索結果

文獻檢索流程見圖1，初始檢索到文獻56篇，語言為英語的文獻有51篇，語言為中文的文獻5篇；重復文獻26篇，閱讀標題剔除文獻8篇，meta分析及綜述類的3篇，詳細閱讀摘要及全文發(fā)現(xiàn)無基因型或非相關基因型的有10篇，無全文的文獻1篇，最終8篇文獻符合納入標準，納入本薈萃分析。其中納入的文獻中有3篇是亞洲人群，5篇屬于高加索人群。所有納入研究的基因型的分布均符合遺傳學HWE平衡（P均＞0.05）。納入的研究均為中高等質量研究（NOS評分均≥5 顆星）。所納入文獻的基本特征和質量評價見表1。

2.2 meta分析結果

CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關性meta分析結果見表2。從meta分析結果可以看出，等位基因模型（OR=1.39，95%CI：1.05；1.84）、純合子模型（OR=2.17，95%CI：1.24；3.79）、顯性模型（OR=1.44，95%CI：1.02；2.03）和隱形模型（OR=1.83，95%CI：1.15；2.89）中觀察到 CYP1A1基 因rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育顯著相關，而與野生純合型TT比較，雜合性CT（OR=1.32，95%CI：0.97；1.79）與特發(fā)性男性不育無相關性。由表2可以看到各個基因模型異質性明顯,差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），故采用隨機效應模型為各獨立研究賦予權重再進行合并。為探究異質性來源，根據(jù)種族（分為亞洲人群和高加索人群）及樣本量大?。ǚ譃闃颖玖浚?00和樣本量≤400）進行亞組分析。如表2所示，根據(jù)種族進行亞組分析不能明確異質性來源，而進一步的亞組分析中顯示，各個比較中沒有進一步確定對男性不育的易感性；根據(jù)樣本量進行亞組分析結果顯示，小樣本量是異質性來源，各個比較中也沒有進一步確定對男性不育的易感性。等位基因模型下CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與男性不育關聯(lián)的森林圖如圖2（其余模型森林圖文中未示出）。

圖1 文獻篩選流程及結果

表1 納入文獻的基本特征

表2 CYP1A1基因rs4646903位點不同基因模型的meta分析結果

續(xù)表2

圖2 等位基因模型meta分析森林圖

2.3 敏感性分析

進行單獨的薈萃分析以研究每個獨立研究對整體薈萃分析估計的影響。圖3表明，遺漏的個體研究的點估計不在等位基因模型的組合分析的95%CI之外。類似地，當對其他模型進行分析時沒有觀察到顯著影響（文中未示出）。這些分析表明，沒有個別研究影響薈萃分析的結果，即研究結果較為可靠和穩(wěn)定。

中間的縱軸是總體合并后的OR值，兩邊的縱軸分別是合并后的OR值的95%可信區(qū)間，每個小圓圈代表省略該項研究后其余研究合并后的OR值，由圖中可以看出無論省略哪些研究其余研究合并后的OR值總是在95%可信區(qū)間內，故各個研究較為穩(wěn)健，結果較為可靠。

2.4 發(fā)表偏倚

在對OR值的比較分析中，等位基因模型、純合模型及隱形模型均沒有發(fā)現(xiàn)發(fā)表偏倚，而在雜合模型和顯性模型分析中Egger's檢驗存在發(fā)表偏倚，而Begger's檢驗無發(fā)表偏倚，如表3，而本薈萃分析納入研究數(shù)量只有8個研究，數(shù)量較少，Begger's檢驗更可靠，可以認為無明顯發(fā)表偏倚。在所有的遺傳模型中，漏斗圖基本對稱，等位基因模型（C/T）Begger's檢驗漏斗圖，見圖4（其他模型文中未示出）。Begger's檢測提示無明顯發(fā)表偏倚（P均＞0.05），結論可信度較高。

表3 Egger's檢驗和Begger's檢驗結果

圖3 個體研究對特發(fā)性男性不育患者CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性的合并OR值等位基因比較的影響

圖4 特發(fā)性男性不育癥等位基因模型下Begger's漏斗圖

3 討論

特發(fā)性男性不育是目前全世界非常突出的一個問題。一些研究表明，在過去幾十年里，人類的精液數(shù)量和質量均顯著下降，可能的原因雖然還不太清楚，但有人提出環(huán)境因素與精子功能不良和不育癥的情況有關[1,21-23]。外界的環(huán)境因素進入人體內會轉化成一種多環(huán)芳烴對人體致病，而CYP1A1酶參與多環(huán)芳烴的I相代謝，代謝過程中產生一種DNA加合物的中間代謝產物，這種中間代謝產物對人類生殖有潛在的毒性[3-4]。CYP1A1基因編碼CYP1A1酶，CYP1A1基因位點的多態(tài)性影響著酶的表達。目前，已經有許多相關文獻報道了CYP1A1基因不同位點的多態(tài)性可能與男性不育相關。Aydos等[24]報道了CYP1A1基因rs4646422位點的多態(tài)性可能導致男性不育。而更多的研究則集中在CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的相關性上，Lu等[13]對中國漢族人群進行了研究，報道認為CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與中國漢族人群男性不育不相關；陳文成等[15]報道CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與中國壯族少精子癥相關；彭亮等[17]報道CYP1A1基因rs4646903與寧夏地區(qū)男性不育不存在相關性，Vani等[14]報道CYP1A1rs4646903與印度男性不育存在相關性。以上結果并不一致，可能與研究的人群、區(qū)域、樣本量大小有關。為了得到一個全面的、可信的關于CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與男性不育的相關性結論，筆者進行了本次研究。通過檢索數(shù)據(jù)庫、制定納入和排除標準、用stata 12.0軟件合并分析數(shù)據(jù)完成了本篇meta分析文章?？傮w而言，在等位基因模型、純合基因模型、顯性模型以及隱形模型中，CYP1A1基因rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育相關，而根據(jù)種族進行亞組分析中卻并沒有進一步顯示男性不育的易感性；根據(jù)樣本量進行亞組分析顯示在大樣本中并沒有表現(xiàn)出男性不育的易感性，相反，在小樣本比較中卻發(fā)現(xiàn)在等位基因模型、顯性模型進一步表現(xiàn)出了對男性不育的易感性，可能與樣本含量小、存在偏倚有關。在進一步的亞組分析中出現(xiàn)這種陰性結果可能是由于meta分析中包含的高加索人和亞洲人的研究和人口數(shù)量有限。既往有學者[25]納入7篇文獻認為等位基因模型、雜合模型、顯性模型和隱形模型中，CYP1A1rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育顯著相關，其進一步的亞組分析顯示，在等位基因模型、雜合模型和顯性模型中，亞洲人群CYP1A1基因rs4646903位點與特發(fā)性男性不育顯著相關。考慮到其納入的一項研究中的基因位點不是CYP1A1rs4646903位點，而且其亞組分析中把印度人歸類于黃種人群，結果偏頗。而在本研究中，距最近的一次meta分析又有2個新的研究能納入meta分析，而且其報道結果也是不同，本研究根據(jù)種族進行亞組分析時結合以往已發(fā)表文獻的人群分類方法及歷史地理情況將印度人群歸類于高加索人，而且納入的8篇文獻質量較高，總體樣本量較大，結果更為可靠，為今后進一步的研究提供參考。

但本次研究也具有較大的局限性，首先，對結果的解釋應該更為審慎，因為大多數(shù)的比較中存在明顯的異質性，雖然通過亞組分析明確了一些基因型異質性的來源；其次，納入的文獻研究中由于缺乏其他匹配因素（諸如年齡、吸煙情況及其他的環(huán)境因素）限制了進一步分層分析以明確異質性來源；此外，納入的樣本量還是偏少，納入的研究主要集中在中國、印度這些國家，還有語種僅限于中文和英語，存在一定的發(fā)表偏倚?？傊?，要準確地得出CYP1A1rs4646903位點多態(tài)性與特發(fā)性男性不育的關系，要綜合考慮到上述各種因素，需要更大的樣本量和更多的研究，還有更為精心的匹配設計才能得到正確而全面的結論。