黃鳳珍，高潤(rùn)昕，李 萌，許 崗，紀(jì)小敏，曹福祥，3

（1.中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省環(huán)境資源植物開(kāi)發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4.湖南福來(lái)格生物技術(shù)有限公司，湖南 長(zhǎng)沙 410100）

羽扇豆醇屬于三萜類化合物，是植物特有的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜和中草藥植物中[1]。在對(duì)一些植物組織，例如細(xì)葉杜香葉、竹節(jié)蓼、柚花、木棉樹皮等的化學(xué)成分進(jìn)行分析時(shí)都發(fā)現(xiàn)了羽扇豆醇的存在[2-5]。羽扇豆醇由于其抗氧化、誘導(dǎo)凋亡、抗惡性腫瘤增殖、抗基因突變以及抗炎癥和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等活性而廣泛應(yīng)用于腫瘤的預(yù)防和治療[6]。惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病之一?；瘜W(xué)藥物雖然對(duì)癌癥療效顯著，但存在較大的毒副作用，相比之下天然抗癌藥物在相同療效的前提下毒副作用更低，具有更高的開(kāi)發(fā)潛力[7-8]。但是此類化合物大多是從植物中直接提取，并且產(chǎn)量極低，對(duì)植物資源有很高的依賴性和破壞性[9]。使用生物技術(shù)手段既可以提高其產(chǎn)量，又可以降低成本，是目前工業(yè)化生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的的主要方向。

羽扇豆醇合酶（LUP）是將鯊烯轉(zhuǎn)化成羽扇豆醇的關(guān)鍵酶。植物體內(nèi)的羽扇豆醇合成途徑如圖1：首先由法尼基焦磷酸合成酶（FPS）將異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）異構(gòu)化生成法尼基焦磷酸（FPP），然后FPP在角鯊烯合酶（SQS）的作用下轉(zhuǎn)化成角鯊烯，接著角鯊烯在角鯊烯環(huán)化酶（SQE）的催化下轉(zhuǎn)化成2,3-環(huán)氧鯊烯，最后氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）使2,3-氧化角鯊烯以陽(yáng)離子中間體的形式環(huán)化成三萜醇或醛[10]。其中陽(yáng)離子中間體可在羽扇豆醇合酶的催化下轉(zhuǎn)化成羽扇豆醇。

圖1 羽扇豆醇合成途徑Fig.1 The synthesis pathway of Lupeol

高量表達(dá)羽扇豆醇合成途徑中的關(guān)鍵基因以實(shí)現(xiàn)羽扇豆醇在細(xì)菌或酵母中的異源合成是目前羽扇豆醇工業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)重要思路。王冬在三萜底盤細(xì)胞BY-T3 的rDNA 多拷貝位點(diǎn)引入烏拉爾甘草來(lái)源的羽扇豆醇合酶基因（LUP）及MVA途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶基因（tHMG1），初步獲得了可生產(chǎn)樺木酸前體羽扇豆醇的底盤細(xì)胞BY-LUP02[11]。林庭庭嘗試通過(guò)創(chuàng)建釀酒酵母細(xì)胞工廠NK2-LUP 發(fā)酵生產(chǎn)羽扇豆醇，然而該工程菌株中羽扇豆醇的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量均很低[12]。筆者前期也進(jìn)行了羽扇豆醇合酶基因在大腸桿菌和酵母中的異源表達(dá)，但均未能獲得具有生物活性的目標(biāo)蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中雖然存在羽扇豆醇合酶基因，但在擬南芥中不能檢測(cè)到羽扇豆醇。因此，本研究嘗試直接以擬南芥為受體，構(gòu)建AtLUP1 超表達(dá)體系，在擬南芥中超量表達(dá)AtLUP1 基因，并檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中羽扇豆醇的含量，觀察提高該基因的表達(dá)量是否能促進(jìn)植物細(xì)胞中羽扇豆醇的合成，為羽扇豆醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

擬南芥（Columbia-0）野生型由本實(shí)驗(yàn)室保存。播種種子于混合泥土（蛭石∶優(yōu)質(zhì)土=1∶3）中，置于光照培養(yǎng)箱（MGC-250HP-2）中，培養(yǎng)條件為：光照時(shí)間16 h（黑暗8 h）；光照強(qiáng)度100～150 μmol/m2·s；培養(yǎng)室溫度為光照條件下20～22 ℃，黑暗條件下18～20 ℃；相對(duì)濕度70%。

1.2 方 法

1.2.1 擬南芥基因組DNA 的提取

選取約0.5 mg 擬南芥幼嫩葉片，加入液氮快速研磨成粉，采用植物基因組DNA 提取試劑盒（天根）提取擬南芥總DNA。提取完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及目標(biāo)基因的克隆

根據(jù)AtLUP1 基因序列設(shè)計(jì)特異引物AtLUP1-Fw/Rs（引物序列見(jiàn)表1），分別在引物兩端加入BamHI 和SacI 酶切位點(diǎn)，以擬南芥基因組DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增?？寺∑芜B接TA 載體后，送往鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序無(wú)誤后將載體命名為pMD18-T/LUP1。由于AtLUP1 基因片段過(guò)長(zhǎng)，故設(shè)計(jì)檢測(cè)引物L(fēng)UP1-T-F/R，克隆AtLUP1基因中長(zhǎng)度約500 bp 的部分片段，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該引物進(jìn)行PCR 以驗(yàn)證AtLUP1 基因的存在。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

載體將含有目標(biāo)基因的載體與植物表達(dá)載體pBI121 分別用內(nèi)切酶BamHI 和SacI 雙酶切，將酶切獲得的目標(biāo)片段切膠回收后用T4 DNA 連接酶連接，獲得含有35S 強(qiáng)啟動(dòng)子與目標(biāo)基因的植物雙元表達(dá)載體（構(gòu)建過(guò)程如圖2）[13]。然后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化參照Z(yǔ)hang[14]的方法進(jìn)行。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的篩選與鑒定

收取T0 代種子，于含有卡那霉素（kan，50 mg/L）及頭孢霉素（cef，200 mg/L）的MS 篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，在篩選平板中挑取且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的幼苗轉(zhuǎn)移至7 cm×7 cm 培養(yǎng)盒中，待其成熟后取葉片，提取DNA，使用表1中的引物NPT-L/R 進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

1.2.5 GC 分析測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株中羽扇豆醇的總量

樣品制備：取T1 代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株0.1 g，液氮研磨后，加入2 mL 乙酸乙酯萃取，振蕩器震蕩20 min，離心，去上清液，真空抽干，抽干后加入100 μL BSTFA，80℃，30min。再加入等體積的氯仿，進(jìn)氣相進(jìn)行分析。

標(biāo)準(zhǔn)品羽扇豆醇的制備：準(zhǔn)確稱取羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于25 mL 容量瓶中，用乙醇溶解并定容。移取1 mL 于試管中，真空抽于后加入100 μL BSTFA，80 ℃，30 min。再加入等體積的氯仿，進(jìn)氣相進(jìn)行分析。

氣相分析采用日本島津GC-2014C氣相色譜儀；色譜柱為毛細(xì)管色譜，HP-5MS 30 m×0.25 mm× 0.25 μm；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫0 min 80 ℃，以25 ℃/min 升至300 ℃，保留15 min；檢測(cè)器：310℃；柱流量1.5 mL /min，分流比10∶1；載氣為N2，流速為1.2 mL/min。

圖2 雙元表達(dá)載體pBI-LUP1 的構(gòu)建流程簡(jiǎn)圖Fig.2 The construction process of the binary expression vector pBI-LUP1

2 結(jié) 果

2.1 擬南芥基因組DNA 的提取及及目標(biāo)基因的克隆

取擬南芥植株新鮮葉片，提取基因組DNA，稀釋至終濃度為100 μg/mL。然后以稀釋后DNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得約5 000 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)測(cè)序，序列長(zhǎng)度為4 302 bp，與已知的AtLUP1 基因序列一致（圖3）。

圖3 AtLUP1 基因的克隆Fig.3 Cloning of the AtLUP1 gene

2.2 AtLUP1 基因序列信息

AtLUP1 基因序列全長(zhǎng)4 302 bp；該段DNA序列中包含16 個(gè)內(nèi)含子，17 個(gè)外顯子，CDS 序列長(zhǎng)度為2 274 bp（圖4）；編碼757 個(gè)氨基酸。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

將質(zhì)粒pBI121 使用內(nèi)切酶BamHI 和SacI進(jìn)行雙酶切（圖5A），切膠回收后用T4 DNA連接酶與同樣使用BamHI 和SacI 雙酶切質(zhì)粒pMD18-T/LUP1的產(chǎn)物（圖5B）連接，將連接成功的質(zhì)粒pBI-LUP1（圖5C）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用檢測(cè)引物L(fēng)UP1-T-F/R（引物序列見(jiàn)表1）PCR 檢測(cè)篩選陽(yáng)性克隆斑（圖5D）。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定與形態(tài)學(xué)分析

從Kan 抗性平板中篩選抗性植株，培養(yǎng)于混合泥土（蛭石∶優(yōu)質(zhì)土=1∶3）中，約一月后，提取DNA，PCR 檢測(cè)NPT Ⅱ基因以篩選陽(yáng)性植株（圖6A）。經(jīng)PCR 檢測(cè)確認(rèn)，共獲得18 株轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生理及形態(tài)進(jìn)行觀察（圖6B），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株的生長(zhǎng)狀態(tài)并無(wú)明顯差異，轉(zhuǎn)基因植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段也與野生型植株沒(méi)有明顯差異，超量表達(dá)AtLUP1 基因?qū)M南芥的生長(zhǎng)發(fā)育未觀察到明顯影響。

圖4 AtLUP1 DNA 序列結(jié)構(gòu)Fig.4 The DNA sequence structure of AtLUP1

圖5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.5 Construction of plant expression vector

2.5 羽扇豆醇含量的測(cè)定

通過(guò)GC 對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的羽扇豆醇含量進(jìn)行分析，當(dāng)t=22.535 min 時(shí)，Lupeol出峰，圖7A 為羽扇豆醇標(biāo)品圖譜，圖7B 為野生型樣品圖譜，圖7C 為樣品48 號(hào)樣品氣相圖譜，根據(jù)圖譜中峰面積大小，計(jì)算出每個(gè)樣品中羽扇豆醇含量，并做成柱形圖（7D）。結(jié)果表明：野生型擬南芥（樣品編號(hào)1）中羽扇豆醇含量最低；轉(zhuǎn)基因植株羽扇豆醇含量超過(guò)0.1 mg/g 的有3 株；其余15 株含量低于0.1 mg/g，但仍高于野生型；48 號(hào)植株羽扇豆醇含量最高，達(dá)0.915 5 mg/g。

圖7 野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因植株中的羽扇豆醇含量Fig.7 Lupeol content in wild-type and transgenic plants

3 結(jié)論與討論

本研究在擬南芥中成功克隆到AtLUP1 基因，該基因CDS 序列為2 274 bp，編碼757 個(gè)氨基酸；通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，獲得AtLUP1 超量表達(dá)擬南芥植株18 株；通過(guò)氣相色譜檢測(cè)擬南芥中羽扇豆醇含量，發(fā)現(xiàn)其中48號(hào)植株中羽扇豆醇含量為0.915 5 mg/g，顯著高于野生型。

近年來(lái)關(guān)于羽扇豆醇抗腫瘤作用及其作用機(jī)理的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。唐澤言研究表明羽扇豆醇能夠抑制人肝癌細(xì)胞Huh-7 的增殖，可能與其介導(dǎo)caspase 活化具有一定的相關(guān)性[15]。郭敏發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇具有抑制膀胱癌T24 細(xì)胞增殖能力，其作用機(jī)制與調(diào)控p53 /miR-34a 通路有關(guān)[16]。王明發(fā)現(xiàn)羽扇豆醇在體外能夠有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，可能與抑制COX-2、MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能是抑制了核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 信號(hào)途徑[17]。除了抗癌之外，羽扇豆醇也有其他功效，郭秀春利用高效液相色譜法分離測(cè)定了錦雞兒中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸和羽扇豆醇的含量，除白樺脂酸外，其他3 種化合物均表現(xiàn)出良好的對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，有望開(kāi)發(fā)成為新的降血糖藥物[18]。但要實(shí)現(xiàn)這些功能的前提就是有足夠量的羽扇豆醇，因此，本研究有一定的實(shí)際意義。

羽扇豆醇合酶基因主要存在于豆科植物中，在其他植物如蓖麻，白樺，百脈根等植物中也存在，并且已經(jīng)成功克隆[19-21]。本研究從擬南芥中克隆到的AtLUP1，該基因CDS 序列為2 274 bp，編碼757個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建了羽扇豆醇合酶超量表達(dá)體系，得到18 株轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型的生理形態(tài)（圖6B）發(fā)現(xiàn)，兩者在生理和形態(tài)上并無(wú)明顯差異，可以推測(cè)該基因并不是擬南芥正常生長(zhǎng)的必需基因，且該基因過(guò)量表達(dá)也不會(huì)影響擬南芥的正常生長(zhǎng)發(fā)育和生物質(zhì)積累，該結(jié)論與陸撿花[22]所得出的結(jié)論相符。通過(guò)GC 對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的羽扇豆醇含量進(jìn)行分析（圖7D），發(fā)現(xiàn)大多數(shù)轉(zhuǎn)基因株系中的羽扇豆醇含量均高于野生型，其中轉(zhuǎn)基因植株48 號(hào)植株中羽扇豆醇含量為0.915 5 mg/g，顯著高于野生型，表明超量表達(dá)AtLUP1 基因可以在擬南芥中促進(jìn)羽扇豆醇的合成。但是該研究有一定的局限性，雖然得到了18 株轉(zhuǎn)基因植株，但是只發(fā)現(xiàn)1 株具有較高的羽扇豆醇含量，推測(cè)該基因的表達(dá)及后期加工比較復(fù)雜，基因拷貝數(shù)、表達(dá)量、插入位點(diǎn)等因素均可能影響其表達(dá)及蛋白產(chǎn)物的合成[23]。另一方面，羽扇豆醇的生物合成可能還需要其他酶的參與，同時(shí)提高多個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)量可能會(huì)對(duì)羽扇豆醇的合成產(chǎn)生加成作用[11]。Costas Delis 對(duì)羽扇豆醇合酶在百脈根不同組織中的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，該基因在百脈根的葉中不表達(dá)，但在幼嫩的根和根瘤中大量表達(dá)，說(shuō)明羽扇豆醇合酶基因的表達(dá)具有組織特異性[21]，因此后續(xù)研究可以分析轉(zhuǎn)基因植株的不同組織（根、莖、葉、花）中的羽扇豆醇的含量，以及不同組織在不同發(fā)育時(shí)期的羽扇豆醇含量，以設(shè)計(jì)最佳的工業(yè)應(yīng)用方法。也可以繼續(xù)篩選羽扇豆醇含量較高的轉(zhuǎn)基因株系并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使其擴(kuò)大培養(yǎng)，為工業(yè)化生產(chǎn)羽扇豆醇提供一個(gè)新的思路。