袁堂豐，瞿利民，郭 婕，2

（1.吉首大學(xué)林產(chǎn)化工加工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000；2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410428）

羅漢松Podocarpus macrophyllus (Thunb.) D.Don 是羅漢松科Podocarpaceae 羅漢松屬Podocarpus 常綠喬木植物，主要分布在我國(guó)江南各省及臺(tái)灣地區(qū)[1]。該植物有多種藥用價(jià)值，其根皮有活血止痛、治療跌打損傷的療效；其葉子能治療風(fēng)濕；其種子有補(bǔ)血益氣、補(bǔ)腎益肺的功效[2]關(guān)于羅漢松的研究，目前主要集中在遺傳多樣性及快速繁殖技術(shù)。近年來(lái)，隨著植物藥用成分分離技術(shù)水平的提高，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)羅漢松及其同屬其它植物的化學(xué)成分和生物活性研究漸多，化學(xué)成分類型涉及二萜、二萜內(nèi)酯以及雙黃酮等成分[3-6]，生物活性研究表明這些化合物具有不同程度的殺蟲、昆蟲拒食、抑菌、抗氧化及抗腫瘤等活性[7-11]。

本文前期對(duì)羅漢松屬植物的二萜成分做了大量調(diào)研和總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其二萜類骨架主要有松香烷型和桃拓烷型，這些二萜表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗氧化和抗炎等活性[5]，結(jié)構(gòu)上具有多取代苯環(huán)的苯基型二萜的特征[12]，有相似的分子結(jié)構(gòu)式和發(fā)色團(tuán)，所以這類二萜化合物在同一波長(zhǎng)處具有相似的紫外吸收特征和相同的吸收系數(shù)，都存在兩個(gè)主要的吸收帶：峰帶Ⅰ（210～220 nm）和峰帶Ⅱ（270～280 nm）。目前有關(guān)羅漢松中總二萜含量測(cè)定和提取工藝尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本文選擇以桃拓酚為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定羅漢松提取物的總二萜含量，并通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)羅漢松總二萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、可靠的總二萜檢測(cè)方法，同時(shí)也為其它羅漢松屬植物總二萜含量的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

樣品于2017年8月采自湖南省張家界市錦程園藝公司，經(jīng)吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為羅漢松科植物羅漢松。

桃拓酚標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自云南昆明西力生物科技有限公司；無(wú)水甲醇、乙酸乙酯、石油醚均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；?shí)驗(yàn)用水均為超純水。

Thermo Evolution 220 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；IKA RV 10 Digital V 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；XO-5200DT 超聲清洗機(jī)；平凡TD5A 臺(tái)式低速離心機(jī)；GZX-9146MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；AEL-40SM 型十萬(wàn)分之一電子天平；AEG-220 型萬(wàn)分之一天平（日本SHIMADZU）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅漢松總二萜的測(cè)定

1.2.1.1 羅漢松總二萜提取

將羅漢松放入鼓風(fēng)干燥箱50℃干燥72 h，用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80 目篩子。取5 g 羅漢松粉末，分別按不同的提取溫度，甲醇濃度和液料比，超聲提取若干次，每次若干分鐘，然后5 000 r/min離心5 min，合并上清液，旋蒸除去溶劑得浸膏。將浸膏懸于200 mL 超純水中先用石油醚萃取除去脂類，再用乙酸乙酯萃取3 次，每次100 mL，收集合并上層液，旋蒸除去乙酸乙酯，然后用無(wú)水甲醇定容至100 mL，得到羅漢松提取液。準(zhǔn)確量取1 mL 羅漢松提取液置于50 mL 容量瓶中，用無(wú)水甲醇定容至刻度備用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備準(zhǔn)確稱取6.10 mg 桃拓酚對(duì)照品于25 mL 容量瓶中，無(wú)水甲醇定容至刻度，搖勻，配得濃度為0.244 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 置 于10 mL 容量瓶中用無(wú)水甲醇定容至刻度，分別得到濃度為0.024 4、0.048 8、0.073 2、0.097 6、0.122 0、0.146 4 mg/mL 的系列桃拓酚標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.1.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取濃度為0.073 2 mg/mL 桃拓酚標(biāo)準(zhǔn)液，以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照，在200～800 nm 范圍內(nèi)掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)為278 nm，見(jiàn)圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取上述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以無(wú)水甲醇作為空白對(duì)照，在278 nm 處測(cè)定吸光度A。以測(cè)定的吸光度A 為縱坐標(biāo)，溶液濃度C 為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=0.007 4C+0.002 3，R2=0.999 8，結(jié)果表明桃拓酚標(biāo)準(zhǔn)液在0.024 4～0.146 4 mg/mL范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。

1.2.1.5 總二萜含量測(cè)定

量取適量的樣品溶液，以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照，于278 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，帶入回歸方程，求出樣品溶液中總二萜質(zhì)量濃度。

1.2.2 羅漢松總二萜提取條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取溫度、甲醇濃度、液料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間為影響因素，研究不同水平下各因素對(duì)羅漢松總二萜得率的影響。

總二萜得率=(CV/M)×100%。

式中：C 為提取液濃度，g/mL；V 為提取液體積，mL；M 為羅漢松粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 響應(yīng)面法分析試驗(yàn)[13]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取溫度、甲醇濃度、和液料比為考察因素，以總二萜得率設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素水平表，見(jiàn)表1。

1.2.4 方法學(xué)試驗(yàn)

按照1.2.1.1 的方法，參照響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率等方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.5 羅漢松總二萜的抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.5.1 DPPH 自由基清除活性測(cè)定

分別取2.0 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，加入0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液2.0 mL，搖勻，室溫下避光30 min，以無(wú)水甲醇作對(duì)照，于517 nm處測(cè)定吸光度A1。對(duì)照組以無(wú)水甲醇代替DPPH甲醇溶液，測(cè)定其吸光度A2。空白組以無(wú)水甲醇代替樣品溶液，測(cè)定其吸光度A0。以相應(yīng)質(zhì)量濃度的Vc 作陽(yáng)性對(duì)照，按公式(1)計(jì)算出DPPH 自由基的清除率，考察羅漢松總二萜清除DPPH 自由基能力的強(qiáng)弱。每組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。

式中：A0為空白組的吸光度；A1為樣品組的吸光度；A2為對(duì)照組的吸光度。

1.2.5.2 羥自由基清除活性測(cè)定

羅漢松二萜對(duì)羥自由基的清除作用參照文獻(xiàn)[14]稍作修改，在10 mL 的具塞試管中依次加入9.0 mmol/L 的FeSO4溶 液2.0 mL，8.8 mmol/L 的H2O2溶液2.0 mL，9.0 mmol/L 的水楊酸-甲醇溶液2.0 mL，最后分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2.0 mL，37 ℃恒溫水浴加熱15 min 后，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度A0′，對(duì)照組以無(wú)水甲醇代替水楊酸-甲醇溶液，測(cè)定其吸光度A2′，空白組以無(wú)水甲醇代替樣品溶液，測(cè)定其吸光度A0′。以相應(yīng)質(zhì)量濃度的Vc 作陽(yáng)性對(duì)照，按下列公式（2）計(jì)算出樣品對(duì)羥自由基的清除率Y′，考察羅漢松總二萜清除羥自由基能力的強(qiáng)弱。每組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。

式中：A0′為空白組的吸光度；A1′為樣品組的吸光度；A2′為對(duì)照組的吸光度。

1.2.5.3 超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定，

采用鄰苯三酚自氧化法，配置1 mL 不同質(zhì)量濃度的樣品，分別加入4.5 mL pH 為8.2，濃度為50.0 mmol/L 的Tris-HCl 緩沖液，并置于25 ℃水浴鍋中20 min，然后加入25 ℃預(yù)熱過(guò)的7.0 mmol/mL鄰苯三酚0.2 mL，混合均勻后反應(yīng)4 min，最后用0.5 mL 濃鹽酸終止反應(yīng)。以超純水為參比溶液，于320 nm 處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1″，空白組以Tris-HCl緩沖溶液代替樣品溶液測(cè)定吸光度值A(chǔ)0″，對(duì)照組以Tris-HCl 緩沖溶液代替鄰苯三酚鹽酸溶液，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2″。根據(jù)公式（3）計(jì)算出樣品羥自由基的清除率Y″，考察羅漢松總二萜清除超氧陰離子能力的強(qiáng)弱。每組做3 次平行試驗(yàn)，取平均值。

式中：A0″為空白組的吸光度；A1″為樣品組的吸光度；A2″為對(duì)照組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取次數(shù)的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1(mL/g)，甲醇濃度為80%，提取溫度為50 ℃，每次提取時(shí)間30 min 的條件下考察不同提取次數(shù)（2、3、4、5 次）對(duì)羅漢松總二萜得率的影響，所有單因素試重復(fù)3 次，取其平均值，結(jié)果見(jiàn)圖2a。由圖2a可知，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3 次時(shí)總二萜得率沒(méi)有明顯變化，同時(shí)在懸蒸時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃縮后浸膏質(zhì)量不在有所增加，證明提取3 次已經(jīng)能夠?qū)⒘_漢松中大部分二萜類成分提取出來(lái)，從節(jié)約試劑的角度考慮，將提取次數(shù)固定為三次。

2.1.2 提取時(shí)間的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1 (mL/g)，甲醇濃度為80%，提取溫度為50 ℃，提取次數(shù)為3 次的條件下考察不同提取時(shí)間（15、20、25、30、35 min）對(duì)羅漢松總二萜得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2b。由圖2b可知，提取時(shí)間超過(guò)20 min后，總二萜得率基本不變，為提高工作效率，將提取時(shí)間固定為20 min。

2.1.3 提取溫度的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在液料比為30∶1(mL/g)，甲醇濃度為80%，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對(duì)羅漢松總二萜得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2c。由圖2c可知，隨著溫度的升高，總二萜得率逐漸增大，當(dāng)溫度為60 ℃最為適宜，繼續(xù)升高溫度，二萜得率反而變小，可能是高溫造成部分二萜發(fā)生降解。因此選取50、60、70 ℃這3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 甲醇濃度的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在提取溫度為60 ℃，液料比為30∶1(mL/g)，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同甲醇濃度（60%、70%、80%、90%和100%）對(duì)羅漢松總二萜得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2d。由圖2d 可知，當(dāng)甲醇濃度從60%升高至80%時(shí)，總二萜得率明顯增加，繼續(xù)提高甲醇濃度，又開(kāi)始變小，這可能是由于甲醇的滲透能力較強(qiáng)，提高甲醇濃度能加速目標(biāo)成分在提取液和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)之間的溶解平衡。因此選取70%、80%和90%這3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 提取次數(shù)(a)、提取時(shí)間(b)、提取溫度(c)、甲醇濃度(d)、液料比(e)對(duì)總二萜得率的影響Fig.2 Effect of extraction times (a),extraction time (b),extraction temperature (c),methanol concentration (d),liquid-solid ratio (e) on the yield of diterpenoids

2.1.5 液料比的影響

按照1.2.1.1 的方法制備樣品，在提取溫度為60 ℃，甲醇濃度為80%，提取次數(shù)3 次，每次20 min 的條件下考察不同液料比（20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1）(mL/g)對(duì)羅漢松總二萜得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2e。由圖2e 可知隨著液料比逐漸增大，總二萜得率顯著增加，繼續(xù)增大液料比，二萜得率基本保持不變。因此，為了滿足較高的得率和節(jié)約溶劑損耗兩方面因素，同時(shí)考慮到濃縮回收的工作量，這里我們選擇20∶1、25∶1、30∶1(mL/g)這3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面分析優(yōu)化工藝

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的方差分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)法，對(duì)羅漢松總二萜進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6.1 軟件對(duì)將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得多元二次回歸方程Y=1.12+0.078A+0.031B+0.069C-0.020AB+0.005AC- 0.033BC-0.150A2-0.150B2-0.100C2方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 2 Effect design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析?Table 3 Variance analysis of regression model

由 表3可 知，該 模 型F=42.10，P ＜0.001，表明該模型高度顯著，方差分析結(jié)果F=3.32，P=0.1386，表明該模型失擬不顯著。模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，其響應(yīng)值得率變化與所選變量提取溫度(A)、甲醇濃度(B)、液料比(C)高度相關(guān)，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)提取羅漢松總二萜的得率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。模擬回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下：一次項(xiàng)A，C，二次項(xiàng)A2，B2，C2對(duì)總二萜得率的影響是極其顯著的，一次項(xiàng)C 對(duì)總二萜得率的影響是顯著的。各因素對(duì)總二萜得率的影響的大小順序?yàn)樘崛囟龋疽毫媳龋炯状紳舛取?/p>

2.2.2 響應(yīng)面圖分析

在回歸模型分析的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-export 8.0.6.1 軟件繪制三維響應(yīng)面圖（圖3）可更直觀地反映交互因素對(duì)羅漢松總二萜得率的影響。等高線的形狀可以反映交互相的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用明顯，而圓形則與之相反[15-16]。圖3a和3c顯示曲面較為陡峭、等高線呈現(xiàn)橢圓形，說(shuō)明提取溫度和甲醇濃度、液料比和甲醇濃度的交互作用對(duì)羅漢松總二萜得率的影響比較明顯；圖3b等高線趨近于圓形，說(shuō)明提取溫度和液料比交互作用不明顯。

圖3 不同因素對(duì)羅漢松總二萜得率的影響Fig.3 Response surface plots illustrating the mutual effects of factors on the yield of diterpenoids

再對(duì)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步典型性分析，得到最佳提取工藝條件為提取溫度為62.68 ℃、甲醇濃度80.46%、液料比26.34（mL/g），預(yù)測(cè)值為1.140 2%。為方便操作，將最優(yōu)方案定為提取溫度63.00 ℃、甲醇濃度80.00%、液料比26.00∶1（mL/g）。按最優(yōu)方案中的條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3 次，試驗(yàn)結(jié)果分別為1.14%、1.13%、和1.12%，取平均值 1.13%（RSD=0.89%）。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)十分接近，表明試驗(yàn)擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，因此基于響應(yīng)面法分析得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有使用價(jià)值。

2.3 測(cè)定方法評(píng)價(jià)

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取濃度為0.073 2 mg/mL 桃拓酚標(biāo)準(zhǔn)液，以無(wú)水甲醇為空白對(duì)照，按照1.2.1.5 的方法，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算其RSD 值為0.2%，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

按照1.2.1.1 的方法，參照響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄數(shù)據(jù)如表4，計(jì)算其RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，該標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 8，RSD 值為0.193 3%，呈現(xiàn)出良好的重復(fù)性。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 Repeatability tests of the determination results

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.2.1.1 的方法，參照響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，按照1.2.1.5 的方法，在120 min內(nèi)定時(shí)測(cè)量其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算其RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 0，RSD值為0.235 3%，表明樣品在2h 內(nèi)檢測(cè)穩(wěn)定。

2.3.4 回收率試驗(yàn)

按照1.2.1.1 的方法，參照響應(yīng)面優(yōu)化后的工藝條件制備樣品，分別量取10 mL 樣品溶液，共6 份，每份加入1.2 mg 桃拓酚對(duì)照品，充分溶解，按照1.2.1.5 的方法，分別測(cè)定其吸光度，記錄數(shù)據(jù)，并計(jì)算出混合后的總二萜含量以及RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，RSD 值為0.266 5%，具有較高的回收率99.67%。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 5 Stability tests of the determination results

表6 回收率試驗(yàn)(n = 6)Table 6 Recovery tests of gallic acid (n = 6)

2.4 抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 羅漢松總二萜清除DPPH 自由基能力

根據(jù)1.2.5.1的方法分別計(jì)算出羅漢松總二萜、Vc 對(duì)DPPH 自由基清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖4所示。

圖4 DPPH 自由基清除能力曲線Fig.4 Curve of DPPH scavenging rate

由圖4可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，總二萜提取液對(duì)DPPH 自由基具有良好的清除能力，且清除能力隨著溶液質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL 時(shí)，總二萜提取液對(duì)DPPH 自由基的清除率達(dá)到了81.71%，而在試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，Vc 清除DPPH 自由基的能力始終強(qiáng)于總二萜提取液。通過(guò)擬合曲線計(jì)算總二萜提取物清除DPPH 自由基的IC50為0.28 mg/mL。

2.4.2 羅漢松總二萜清除羥自由基能力

根據(jù)1.2.5.2的方法分別計(jì)算出羅漢松總二萜、Vc 對(duì)羥自由基的清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖5所示。

圖5 羥自由基清除能力曲線Fig.5 Curve of hydroxyl free radical scavenging capacity

由圖5可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，總二萜提取液對(duì)羥自由基的清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，存在明顯的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL 時(shí)，總二萜提取液和Vc 對(duì)羥自由基的清除率分別為66.27%、98.87%，通過(guò)擬合曲線計(jì)算出兩者的IC50分別為0.37 mg/mL、0.12 mg/mL。與Vc 相比，總二萜提取液對(duì)羥自由基的清除能力較弱。

2.4.3 羅漢松總二萜清除超氧陰離子能力

根據(jù)1.2.5.3的方法分別計(jì)算出羅漢松總二萜、Vc 對(duì)超氧陰離子的清除率，得到兩種抗氧化劑的清除曲線，如圖6所示。

由圖6可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，總二萜提取液和Vc 對(duì)超氧陰離子具有不同程度的清除能力，且清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，存在量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.59 mg/mL 時(shí)，總二萜提取液和Vc 對(duì)超氧陰離子的清除率分別為38.60%、97.13%，總二萜提取液對(duì)超氧陰離子的清除能力明顯弱于Vc，但仍有一定的清除活性。

圖6 超氧陰離子清除能力曲線Fig.6 Curve of superoxide anion radical scavenging capacity

3 結(jié)論與討論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)羅漢松總二萜提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)分析試驗(yàn)結(jié)果得到，影響羅漢松總二萜得率的因素主次順序?yàn)椋禾崛囟?A)＞液料比(C)＞甲醇濃度(B)，最佳提取條件為：提取次數(shù)3 次、每次20 min、提取溫度63.00 ℃、甲醇濃度80.00%、液料比26.00∶1(mL/g)，總二萜得率為1.13%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明該模型可靠性較高，能很好的預(yù)測(cè)各因素與得率間的關(guān)系?？寡趸钚栽囼?yàn)結(jié)果表明，羅漢松總二萜對(duì)DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子3 種自由基具有不同程度的清除能力，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.59 mg/mL 時(shí)，清除率分別為81.71%、66.27%、38.60%，抗氧化活性較好。苯基二萜除了具有良好的抗氧化活性外，還有著顯著的抗腫瘤、抗病毒等活性[17]，極具開(kāi)發(fā)價(jià)值。本研究已初步證明羅漢松總二萜提取物具有良好的抗氧化活性，但總二萜的其他生物活性及單體二萜的純化和生物活性有待進(jìn)一步研究。