王英澤 曹晴晴 王晨晨 劉桂沅 杜朝

摘要：為了探討中藥復(fù)方對小鼠脾臟淋巴細胞PD-1/PD-L1的表達情況，以及CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞比例的影響，采用傳統(tǒng)熬制中藥的方法得到中藥復(fù)方提取液，按低、中、高3個濃度對小鼠灌胃給藥（1次/d），2周后，采用腦脊髓脫臼法處死小鼠，利用Real-time PCR和流式細胞儀檢測脾臟PD-1/PD-L1的表達情況以及淋巴細胞亞型的變化。結(jié)果表明，隨著中藥提取液濃度的增加，脾臟淋巴細胞PD-1的表達顯著降低，而PD-L1的表達無顯著變化;CD3+CD4+型和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例均顯著增加。所研制的中藥復(fù)方能抑制淋巴細胞PD-1的表達，激活免疫輔助細胞和效應(yīng)細胞，有望應(yīng)用于抗腫瘤的免疫治療。

關(guān)鍵詞：細胞免疫學(xué);中藥復(fù)方;T淋巴細胞;PD-1/PD-L1;CD3+CD4+/CD3+CD8+

中圖分類號：R2855文獻標(biāo)志碼：A

WANG Yingze， CAO Qingqing， WANG Chenchen， et al.Effect of a kind of Chinese herbal compound on the expression of PD-1/PD-L1 in spleen lymphocytes of mice[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2019，40（1）：32-37.Effect of a kind of Chinese herbal compound on the expression of

PD-1/PD-L1 in spleen lymphocytes of mice

WANG Yingze1， CAO Qingqing1， WANG Chenchen1， LIU Guiyuan2， DU Chao1

（1.School of Biological Science and Engineering， Hebei University of Science and Technology， Shijiazhuang，Hebei 050018， China; 2. Langfang Institute of Traditional Chinese Medicine，Langfang，Hebei 065000，China ）

Abstract：In order to investigate the effect on the expression of PD-1/PD-L1 and the proportion of CD3+CD4+， CD3+CD8+ T lymphocyte in spleen lymphocytes of mice treated with Chinese herbal compound， the extract of Chinese herbal compound is obtained by traditional boiling method. The mice are given intragastric administration once a day with extract of Chinese herbal compound at low， medium and high concentrations. The mice are sacrificed by neck dislocation at the end of experiment time and the spleen is freshly isolated from mice. The expression of PD-1/PD-L1 and the changes of lymphocyte subtypes are detected by Real-time PCR and flow cytometry. The results show that the expression of PD-1 on splenic lymphocytes decreases significantly and the ratio of CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T lymphocytes increases significantly with the increase of the concentration of Chinese herbal compound， but the expression of PD-L1 does not change significantly. These results suggest that the Chinese herbal compound can be used in anti-tumor immunotherapy mediated by inhibiting the expression of PD-1 in lymphocytes， activating immune helper cells and effector cells.

Keywords：cell immunology; Chinese herbal compound; T lymphocyte; PD-1/PD-L1; CD3+CD4+/CD3+CD8+

PD-1（programmed cell death 1， 程序性死亡受體1，CD279）來源于CD28家族，主要在活化的T細胞、B細胞、自然殺傷（NK）細胞、巨噬細胞等免疫細胞中表達[1-2]，其配體PD-L1（也稱B7-H1/CD274）主要在腫瘤細胞和抗原提呈細胞（APC）中表達。PD-L1與T細胞PD-1結(jié)合會導(dǎo)致T細胞的衰竭與功能障礙，并分泌促炎因子如TNF-α，IL-2，IFN-γ[3]。利用抗PD-1或抗PD-L1單克隆抗體可阻斷PD-1/PD-L1相互作用，從而減輕對T細胞的抑制[4]。研究表明，通過阻斷PD-1/PD-L1的相互作用，可顯著提高特異性的T淋巴細胞對骨肉瘤的殺傷效果，延長荷瘤鼠的存活時間[5]。迄今，PD-1/PD-L1阻斷劑作為一種通過調(diào)節(jié)免疫細胞與腫瘤細胞相互作用的癌癥治療方法，展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效應(yīng)[6]，是目前具有較好應(yīng)用前景的腫瘤治療途徑。

河北科技大學(xué)學(xué)報2019年第1期王英澤，等：一種中藥復(fù)方對小鼠脾臟淋巴細胞PD-1/PD-L1表達的影響中藥作為一種純天然的藥物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒[7]以及促進免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性，因其在疾病治療過程中具有耐藥性低、毒副作用小、無殘留及增強機體免疫力等優(yōu)點而倍受研究者的關(guān)注。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、金銀花、野菊花、甘草等中藥成分能夠通過提高機體的固有免疫和特異性免疫能力發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等功能，而這些功能的發(fā)揮主要與中藥中所含的多糖、黃酮類、苷類等活性成分有關(guān)[8-13]。這些復(fù)方成分針對抗腫瘤機制的研究主要集中在抗氧化、阻滯細胞周期、促凋亡和抑制新生血管生成等方面[14-15]，而針對與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的PD-1/PD-L1免疫檢查點的研究未見報道。

筆者采用上述中藥成分，配以鬼針草、半枝蓮組成中藥復(fù)方，采用低、中、高劑量灌胃法處理小鼠，從分子和細胞水平檢測了小鼠脾臟PD-1和PD-L1的表達情況，在細胞水平分析了T淋巴細胞亞群CD3+CD4+和CD3+CD8+表達的變化，探討中藥復(fù)方對小鼠T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

中藥復(fù)方（黃芪20 g、金銀花10 g、野菊花15 g、鬼針草20 g、半枝蓮20 g、甘草5 g）;小鼠淋巴細胞分離液（達科為，產(chǎn)地北京）;TRIzol（Invitrogen）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）;胎牛血清（HyClone）;Anti-Mouse CD274（B7-H1）PE，Anti-Mouse CD274（PD-1）FITC，Anti-Mouse CD3e FITC，Anti-Mouse CD4 PE，Anti-Mouse CD8a（B7-1）APC（eBioscience）。

實時熒光定量PCR儀（IQ5，Bio-Rad），細胞分選儀（accuri C6，BD公司生產(chǎn)），超微量分光光度計（DS-11+，DeNovix）。

1.2方法

1.2.1中藥復(fù)方的制備

稱取黃芪20 g、金銀花10 g、野菊花15 g、鬼針草20 g、半枝蓮20 g、甘草5 g，粉碎，經(jīng)3次煎煮，離心（5 000 r/min）后取上清液，經(jīng)0.2 μm濾器過濾除菌，配制成濃縮液（總藥材量/藥液體積：100 mg/mL）。用無菌水將藥物濃縮液稀釋至10 mg/mL和50 mg/mL，于4 ℃保存。

1.2.2實驗動物分組及處理

清潔級Balb/c小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)小鼠7 d后，將15只小鼠隨機分成5組（每組3只），分別為空白對照組、生理鹽水組、低劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（500 mg/kg）、高劑量組（1 000 mg/kg），每日灌胃1次。灌胃期間不限飲食，自由飲水，隔天稱重并觀察各組小鼠生長情況。2周后，所有小鼠均禁食12 h，采用腦脊髓脫臼法處死。取出脾臟，以生理鹽水沖洗后，將50 mg左右的脾臟經(jīng)液氮凍存后置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA;其余脾臟經(jīng)分離得到脾臟淋巴細胞后，用于檢測細胞表面的PD-1蛋白表達情況及CD34+和CD38+表型比例的變化。

1.2.3Real-time PCR

取50 mg脾臟組織，采用Trizol法提取總RNA，采用超微量分光光度計測定RNA濃度，判定純度后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA 作為模板，進行Real-time PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參基因。擴增PD-1的程序如下：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60.9 ℃，1 min;40 cycles。擴增PD-L1的程序如下：95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;60.1 ℃，1 min;40 cycles。50 μL反應(yīng)體系，其中25 μL 2×SYBR Green mixture，10 μmol/L正向和反向引物各2 μL，10 μL cDNA，11 μL無RNase水，混勻后，分至3管，每管15 μL。引物序列見表1。

1.2.4脾臟淋巴細胞分離

采用腦脊髓脫臼法處死小鼠，浸泡于75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇中，在超凈臺上取出小鼠脾臟，在35 mm培養(yǎng)皿中放入1～2 mL淋巴細胞分離液，研磨至碎片。把懸有脾臟細胞的分離液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，覆蓋200～500 μL的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫，800×g離心30 min，吸出淋巴細胞層移至新管。再加入0.5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫，500×g離心10 min，收集細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）懸浮細胞，計數(shù)。

1.2.5脾臟淋巴細胞的表型及PD-1的流式檢測

將收集得到的淋巴細胞用預(yù)冷的PBS清洗2遍，100 μL PBS（預(yù)冷）重懸，加入相應(yīng)抗體，于冰上避光孵育30 min，利用細胞流式儀進行檢測。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗所有數(shù)量值均采用x±s表示，組間比較采用t檢驗，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1中藥復(fù)方對小鼠體質(zhì)量變化無影響

為探討藥物劑量是否影響小鼠的生長狀況，對各組小鼠的體質(zhì)量隔日稱重，持續(xù)2周。圖1 a）顯示，與生理鹽水組相比，不同劑量的中藥復(fù)方處理對小鼠體質(zhì)量的變化無顯著影響（P>0.05），表明在實驗設(shè)定的劑量濃度下，中藥復(fù)方對小鼠的正常生長狀態(tài)無毒性作用。

2.2中藥復(fù)方能下調(diào)小鼠脾臟淋巴細胞PD-1基因的表達水平

為探討中藥復(fù)方能否干擾淋巴細胞PD-1/PD-L1基因的表達，利用Real-time PCR檢測不同劑量中藥復(fù)方對小鼠脾臟PD-1和PD-L1 mRNA表達水平的影響情況，結(jié)果見圖1 b）。與生理鹽水組相比，低濃度的中藥復(fù)方處理即可顯著降低PD-1的mRNA水平（P<0.05），而且，隨著中藥復(fù)方濃度的逐漸提高，PD-1 mRNA表達水平的降低幅度逐漸增大，表明中藥復(fù)方可以顯著下調(diào)小鼠脾臟組織PD-1 mRNA的表達，且呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴效應(yīng)。與此不同，對脾臟組織中PD-L1 mRNA的表達水平雖有一定抑制，但差異不顯著（P>0.05），表示此中藥復(fù)方可能只是通過干擾PD-1的表達來降低腫瘤免疫逃逸。

2.3中藥復(fù)方能顯著降低小鼠脾臟淋巴細胞PD-1蛋白表達的水平

為探究中藥復(fù)方處理對PD-1 mRNA水平的影響能否反映其在蛋白水平的變化情況，采用流式細胞術(shù)分析了小鼠脾臟淋巴細胞表面PD-1蛋白表達的情況。由圖2可知，不同濃度的中藥復(fù)方處理都使小鼠脾臟淋巴細胞表面的PD-1蛋白量減少（P<0.05），但不存在濃度依賴效應(yīng)。這些結(jié)果表明，在中藥復(fù)方的作用下，小鼠脾臟淋巴細胞表面PD-1蛋白水平與相應(yīng)的mRNA水平變化趨勢一致，推測中藥復(fù)方可能抑制PD-1的轉(zhuǎn)錄或影響其mRNA穩(wěn)定性，從而減少細胞表面PD-1蛋白的表達量。T細胞表面PD-1蛋白的減少有助于抑制腫瘤免疫逃逸，這可能是中藥復(fù)方保護和調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的重要分子基礎(chǔ)。

2.4中藥復(fù)方能提高小鼠脾臟中CD3+CD4+/CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例

為探討中藥復(fù)方對小鼠脾臟T淋巴細胞亞型的影響，采用流式細胞術(shù)檢測CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例，結(jié)果見圖3。與生理鹽水組相比，當(dāng)給予低劑量的中藥復(fù)方時，小鼠脾臟中CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例均顯著降低;給予中劑量處理后，CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴細胞比例有所增加;給予高劑量處理后，CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例均顯著提高，分別達20.9%和11.3%（P<0.05），表明中藥復(fù)方能夠顯著提高小鼠脾臟淋巴細胞的CD3+CD4+和CD3+CD8+型比例，其變化趨勢與處理劑量有關(guān)，初步說明中藥復(fù)方具有通過激活機體免疫抑制腫瘤的潛質(zhì)。

3討論

1）脾臟作為機體重要的淋巴器官，聚集著大量的淋巴細胞和巨噬細胞，在機體細胞免疫和體液免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。中藥復(fù)方對特異性免疫和非特異性免疫均有促進作用，除了具有提高機體免疫力、抗病毒、抗氧化等功效外，中藥復(fù)方亦能夠通過激活T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞等免疫細胞，促進產(chǎn)生細胞因子，從而激活補體系統(tǒng)等方式調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)[16-17]。在免疫力低下的情況下，中藥復(fù)方能夠促進血清中的免疫球蛋白和溶血素含量升高，增強腹腔巨噬細胞的吞噬能力，從而提高小鼠的免疫功能[18]。

2）在腫瘤治療過程中，如何克服免疫逃逸一直是備受關(guān)注的課題。癌細胞會采用各種策略，利用免疫檢驗點，逃避抗腫瘤免疫，如引發(fā)具有腫瘤反應(yīng)活性的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T-lymphocytes， CTLs）功能衰竭。PD-1作為一個主要的檢驗點受體，在結(jié)合其配體PD-L1后，可以通過抑制T細胞受體（T cell receptor， TCR）的下游信號，抑制T細胞的功能。腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment， TME）中PD-1的配體特別是PD-L1的表達，能使癌細胞免受免疫介導(dǎo)的排斥作用[19-20]。以針對PD-1/PD-L1通路抗體為基礎(chǔ)治療的許多方法已進入臨床研發(fā)階段，或已被批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤等[21]。本研究針對中藥復(fù)方是否影響小鼠T淋巴細胞功能相關(guān)的免疫檢查點PD-1/PD-L1的表達開展了相關(guān)研究。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過藥物處理后，小鼠脾臟T淋巴細胞的PD-1表達量顯著減少。PD-1的mRNA水平和蛋白水平變化趨勢一致，而且mRNA水平的變化呈現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)，說明中藥復(fù)方可能是通過抑制PD-1基因轉(zhuǎn)錄，或降低其mRNA穩(wěn)定性發(fā)揮作用。中藥復(fù)方降低T淋巴細胞表達的PD-1，有助于抑制腫瘤免疫逃逸。因此上述結(jié)果初步闡明了中藥復(fù)方具備調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)的能力。

3）具有腫瘤反應(yīng)活性的CD3+CD4+和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例在經(jīng)高劑量藥物處理后顯著增加，提示中藥復(fù)方有助于激活免疫輔助細胞和效應(yīng)細胞，這可能也是其調(diào)控免疫能力的分子基礎(chǔ)之一。

4結(jié)語

1）利用黃芪、金銀花等6種成分組成的中藥復(fù)方處理小鼠，探討了其對脾臟淋巴細胞PD-1/PD-L1免疫檢查點的影響。結(jié)果顯示，此中藥復(fù)方可以顯著降低脾臟淋巴細胞PD-1的表達，提高CD3+CD4+型和CD3+CD8+型T淋巴細胞的比例。說明此中藥復(fù)方能干擾免疫檢查點PD-1/PD-L1的表達，激活免疫輔助細胞和效應(yīng)細胞，為中藥用于抗腫瘤的免疫治療研究提供了數(shù)據(jù)參考。

2）中藥復(fù)方抑制T淋巴細胞PD-1基因表達呈現(xiàn)出一定的特異性，因為脾臟組織中PD-L1基因的表達情況并沒有因藥物處理而發(fā)生顯著變化。采用PD-1抗體治療黑色素瘤的有關(guān)研究顯示，黑色素瘤細胞亦可表達PD-1，促進自身增殖。在阻斷免疫檢驗點的同時，抗體還能通過作用于腫瘤表面的PD-1抑制腫瘤生長[22]。中藥復(fù)方是否能夠通過抑制腫瘤細胞的PD-1表達來抑制腫瘤，是今后需要進一步關(guān)注的重點。

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2019年2月Journal of Hebei University of Science and TechnologyFeb. 2019