何曉亮 李竹 梁立強(qiáng) 孟萬(wàn)利

摘要：為了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的結(jié)構(gòu)和功能，采用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、雙酶切和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等基因工程方法對(duì)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因進(jìn)行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行表達(dá)分析，擴(kuò)增出一個(gè)新的大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，將其基因克隆到原核表達(dá)載體pET-30a上，并導(dǎo)入到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)出大腸桿菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能夠高效表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，為進(jìn)一步大規(guī)模表達(dá)純化和應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：基因工程;大腸桿菌;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶;基因表達(dá);二氧化碳

中圖分類號(hào)：Q812文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Abstract：In order to better study the structure and function of phosphoenolpyruvate carboxylase， the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is cloned and expressed by PCR （polymerase chain reaction）， double enzyme digestion and cell transformation. The results show that the new phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli is successfully amplified and cloned into the prokaryotic expression vector pET-30a， and then introduced into Escherichia coli BL21 expression system. The phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli is successfully induced by IPTG. The phosphoenolpyruvate carboxylase can be efficiently expressed by using the proposed method， which provides preparation for further scale expression， purification and application.

Keywords：genetic engineering; Escherichia coli; phosphoenolpyruvate carboxykinase; protein expression; CO2

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）是一種存在于磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸過(guò)程中的催化酶[1-3]。PEPC酶在Mg2+和HCO-3存在的情況下催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）不可逆的β-羧化生成草酰乙酸（OAA）和無(wú)機(jī)磷酸（Pi）[4-5]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶廣泛存在于植物和細(xì)菌中，而動(dòng)物和絲狀霉菌中缺少這種酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶屬于變構(gòu)酶，主要功能為三羧酸循環(huán)提供草酰乙酸，另外也與C4植物光合二氧化碳固定反應(yīng)（C4二羧酸循環(huán)）及景天科植物的蘋(píng)果酸形成（景天酸代謝）等有關(guān)[6]。非光合型PEPC酶參與四碳酸的回補(bǔ)代謝途徑[7]。植物PEPC的生理作用還包括：種子萌發(fā)和形成[8]、調(diào)節(jié)保衛(wèi)細(xì)胞[9]、促進(jìn)蘋(píng)果酸的合成為固氮根瘤菌提供呼吸基質(zhì)[10]，并且在植物抗生物和非生物脅迫中有重要作用[11]。

此外，PEPC酶參與NADPH代謝、C-N的交互反應(yīng)、CO2的重吸收、蘋(píng)果酸發(fā)酵和pH調(diào)節(jié)等眾多重要的生理過(guò)程[12]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β桶型結(jié)構(gòu)、α螺旋為主，還有少量的β鏈[13-14]。它的4個(gè)亞基是以同構(gòu)方式結(jié)合，其四級(jí)結(jié)構(gòu)屬于D2對(duì)稱性，在空間上可能排列成擬四面體[15]。通常植物PEPC的氨基酸序列具有高度的保守型[16]，殘基數(shù)一般為960～970[17]，在N末端附近有磷酸化位點(diǎn)（E/DR/KxxSIDAQL/MR）是植物特有的結(jié)構(gòu)[18]。位于C端的963QNTG966基序與PEPC催化活性有關(guān)[19]。

為了更好地研究PEPC酶的結(jié)構(gòu)和功能的特征，本研究克隆了大腸桿菌的PEPC基因的序列并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，旨在為PEPC酶結(jié)構(gòu)和功能的研究提供一定的信息。

1材料與方法

1.1材料

原核表達(dá)載體pET-30a由河北科技大學(xué)周曉輝教授饋贈(zèng)，大腸桿菌JM109，DH5α，BL21（DE3）購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1PCR擴(kuò)增

大腸桿菌JM109基因組DNA提取的方法按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)（北京天根）進(jìn)行。按照從National Center for Biotechnology Information （NCBI）上檢索到的大腸桿菌pepc基因序列的ORF使用Prime primer 5.0設(shè)計(jì)上、下游引物，分別加入Bam HI（GGATCC）和Hind III（AAGCTT）限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，引物由上海英濰捷基公司合成，具體序列如下：

上游引物：5-CGCGGATCCATGCGCGTTAACAATGGTTTGAC-3。

下游引物：5-GGCAAGCTTTTACAGTTTCGGACCAGCCGCTAC-3。

以大腸桿菌基因組DNA為模板在Gene Amp PCR system 9700進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增pepc基因序列，PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35 次;72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)后使用膠回收試劑盒（北京全式金）回收，送交測(cè)序公司（上海英濰捷基）測(cè)序[20]。

1.2.2重組表達(dá)載體pET-30a-pepc的構(gòu)建

pET-30a質(zhì)粒的提取按照質(zhì)粒提取試劑盒（GenStar BioSolutions）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。質(zhì)粒提取完畢之后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。pepc基因擴(kuò)增產(chǎn)物的回收產(chǎn)物和pET-30a質(zhì)粒分別用Bam HI和Hind III（TAKARA）進(jìn)行雙酶切，pET-30a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后要用去磷酸化酶（New England Biolabs）處理，酶切反應(yīng)和去磷酸化反應(yīng)后均用膠回收試劑盒（北京全式金）進(jìn)行回收。經(jīng)過(guò)雙酶切處理的基因和載體，用T4DNA連接酶（TAKARA）連接。連接好的重組體使用熱激的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，利用PCR技術(shù)和雙酶切技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而將驗(yàn)證正確的送交測(cè)序公司（上海英濰捷基）測(cè)序進(jìn)行鑒定。

1.2.3PEPC酶的表達(dá)

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，獲得pET-30a-pepc-BL21重組菌株。將過(guò)夜培養(yǎng)的pET-30a-pepc-BL21菌液，按2%接種量，依次轉(zhuǎn)接于9瓶50 mL的LB（100 μg/mL Kan）液體培養(yǎng)基中，160 r/min，37 ℃培養(yǎng)。至OD600 nm為0.4～0.6，加入終濃度依次為0，0.01，0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，37 ℃時(shí)誘圖1大腸桿菌基因組DNA電泳鑒定

Fig1Gel analysis of genome DNA from

Escherichia coli.導(dǎo)3～4 h，OD600 nm值到2.0左右。8 000 r/min，4 ℃離心15 min。用細(xì)胞懸浮液重新懸浮上述離心后的菌體沉淀，加入終濃度為0.1 mmol/L PMSF和一片蛋白酶抑制劑。使用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝）進(jìn)行細(xì)胞破碎（破碎10 min，其中工作3 s間隔5 s），進(jìn)而用超速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter）14 000 r/min，4 ℃離心30 min，取上清液。分別取各組的上清液，制備樣品，用SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)情況。

2結(jié)果與分析

2.1大腸桿菌pepc基因的克隆

2.1.1大腸桿菌基因組DNA的提取

按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒所提供的提取方法提取大腸桿菌JM109的基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果，如圖1所示。結(jié)果顯示出現(xiàn)了目的條帶，且該條帶的大小比DNA Marker的最大條帶要大得多，說(shuō)明基因組提取成功。

2.1.2pepc基因的PCR擴(kuò)增

以大腸桿菌基因組DNA為模板，利用上、下游引物克隆pepc基因，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示在1 600 bp左右出現(xiàn)了條帶，并且條帶單一，大小與理論值相符，結(jié)果見(jiàn)圖2所示，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)正確，目的基因擴(kuò)增成功。

2.1.3重組表達(dá)載體pET-30a-pepc

將pepc基因和pET-30a質(zhì)粒分別經(jīng)Bam HI和Hind III酶切，然后在T4 DNA連接酶的作用下，將酶切產(chǎn)物連接成為重組質(zhì)粒pET-30a-pepc，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)連接結(jié)果，如圖3所示。結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的大小明顯比空載的pET-30a大，說(shuō)明目的基因成功連接到載體pET-30a上。

2.1.4雙酶切驗(yàn)證

提取重組質(zhì)粒pET-30a-pepc，并將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果為酶切后的混合物內(nèi)含有與目的基因大小一致的片段，表明pepc基因成功插入pET-30a質(zhì)粒，電泳結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，如圖4所示。

2.1.5重組質(zhì)粒的測(cè)序驗(yàn)證

將雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒，送交測(cè)序公司測(cè)定堿基序列，并與NCBI上的pepc基因的測(cè)序結(jié)果比對(duì)，其比對(duì)結(jié)果為99%，如圖 5所示，即重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，該基因編碼完整的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。

2.2重組表達(dá)載體pET-30a-pepc在大腸桿菌中的表達(dá)

用15%的SDS-PAGE驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果。由圖6可知，在66.2 kDa附件出現(xiàn)一條明顯的條帶，與理論值66 kDa相符，說(shuō)明該蛋白能夠單獨(dú)表達(dá)，IPTG濃度高蛋白表達(dá)量也高。

3結(jié)論

1） 利用基因工程的技術(shù)和方法成功克隆到新的大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，并且成功構(gòu)建了表達(dá)菌株。接種量的多少直接影響菌種的生長(zhǎng)情況，通過(guò)對(duì)表達(dá)菌株的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定了2%的接種量最合適，為大規(guī)模的培養(yǎng)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因工程菌株提供了數(shù)據(jù)參考。

2） IPTG的濃度對(duì)基因的表達(dá)效果和蛋白質(zhì)的最終濃度，通過(guò)添加不同濃度的IPTG，確定了最佳誘導(dǎo)濃度。

3） 建立的方法確實(shí)能夠高效表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，如何更大規(guī)模地表達(dá)該酶是今后需要進(jìn)一步關(guān)注的重點(diǎn)。

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