李小娟 李杰 周瑚

摘要本研究以稻曲病菌Ustilaginoidea virens黃色（非休眠）厚垣孢子、黑色（休眠）厚垣孢子、厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的分生孢子（非休眠）3種孢子為材料，采用DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)對(duì)供試材料基因組DNA進(jìn)行甲基化分析，探究稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式。結(jié)果顯示，3種形態(tài)孢子的基因組DNA甲基化水平差異明顯，分生孢子基因組DNA中CCGG序列的總甲基化率為20.56%，黑色休眠厚垣孢子為25.63%，黃色非休眠厚垣孢子為33.52%。黃色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，其全甲基化率高于半甲基化率，其中黃色厚垣孢子全甲基化率高達(dá)17.68%;分生孢子則是以半甲基化模式為主。結(jié)果對(duì)揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠的分子機(jī)制，探究真核生物孢子的分子休眠機(jī)制有普遍意義。

關(guān)鍵詞稻曲病菌;厚垣孢子;分生孢子;DNA甲基化;甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性

中圖分類號(hào)：S 435.111

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2017475

稻曲病是由稻綠核菌Ustilaginoidea virens （Cooke） Takahashi[有性態(tài)為Villosiclava virens （Nakata） E.Tanaka & C.Tanaka，異名Claviceps oryzaesativae Hashioka] 侵染引起的水稻穗部病害[1]。該病在亞洲、美洲和非洲的30多個(gè)國(guó)家及我國(guó)各稻區(qū)都有不同程度發(fā)生。一般穗發(fā)病率為4%～6%，嚴(yán)重達(dá)50%以上。它不僅使秕谷率、青米率、碎米率增加;而且當(dāng)?shù)竟戎泻?.5%病粒時(shí)能引起人畜中毒癥狀[17]。該病在我國(guó)無(wú)論是從發(fā)生面積，還是從引起的產(chǎn)量損失上看，都已成為水稻尤其是雜交稻最重要的病害之一[2， 4]。

在稻曲病發(fā)展過(guò)程中，稻曲球中的厚垣孢子在發(fā)育過(guò)程中存在顏色轉(zhuǎn)變，即從最初乳白色至黃色再到墨綠色（亦稱之黑色），黃色厚垣孢子的萌發(fā)率可高達(dá)80%以上。隨著厚垣孢子顏色變深，萌發(fā)率下降，當(dāng)變成黑色厚垣孢子就很難萌發(fā)或不能萌發(fā)[89]。這種由非休眠（黃色）至休眠（黑色）狀態(tài)的轉(zhuǎn)變對(duì)厚垣孢子度過(guò)不良環(huán)境和宿主缺乏期 （在植物病理學(xué)上的越冬或越夏） 有重要的生物學(xué)意義。厚垣孢子在稻曲病的侵染循環(huán)中起重要作用，是稻曲病的主要初侵染源[812]。

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾。它是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTase）介導(dǎo)，在胞嘧啶的第5位碳原子上加上1個(gè)甲基基團(tuán)，使之變成5甲基胞嘧啶（5mC）的化學(xué)修飾過(guò)程。在各種疾病的致病機(jī)制中，甲基化模式異常這一因素所起的作用各不相同。在真核生物中通常DNA的甲基化會(huì)抑制基因表達(dá)。DNA的甲基化狀態(tài)對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)維持、X染色體失活、基因印記及胚胎發(fā)育、正常細(xì)胞功能的維持，組織特異性基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)座子沉默，乃至疾病的發(fā)生十分重要[1314]。

關(guān)于真菌DNA甲基化研究，早在1983年Tamame等[15]利用5氮雜胞苷（5azacytidine）對(duì)Aspergillus niger和A.nidulans的菌絲進(jìn)行誘變，研究其野生型和誘變型菌絲DNA甲基化，結(jié)果顯示，它們?cè)贒NA甲基化方面沒有差異。隨后，1984年Antequera等[16]對(duì)涵蓋5個(gè)科的20個(gè)種（包含壺菌、卵菌、接合菌、子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌）進(jìn)行了DNA甲基化檢測(cè)，其中18個(gè)種DNA甲基化率≤0.1%，而Sporotrichum dimorphosporum和 Phycomyces blakesleeanus的DNA甲基化率則分別約為0.2%和0.5%。研究表明，真菌中存在DNMTase和甲基化區(qū)域[1719]。對(duì)模型真菌子囊菌粗糙脈孢菌Neurospora crassa的研究顯示，真菌DNA甲基化是一種特定的基因組防御，因經(jīng)過(guò)重復(fù)誘導(dǎo)點(diǎn)突變沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因、沉默轉(zhuǎn)座因子和重復(fù)的DNA序列[2021]。在稻瘟病菌Magnaporthe oryzae中存在DNA甲基化，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子MAGGY對(duì)反轉(zhuǎn)錄的限制作用與DNA甲基化沒有相關(guān)性[22]。不同的M.oryzae單孢其甲基化也有差異，缺失MoDMT1的突變體菌株與正常菌株的生長(zhǎng)無(wú)差異[23]，但DNA甲基化在全基因組分布和對(duì)真菌的生活周期的意義是未知的。Jeon等[24]分析了M.oryzae的DNA甲基化，表明DNA甲基化有助于真菌的生長(zhǎng)發(fā)育和基因組防御。

本研究以稻曲病的黃色、黑色厚垣孢子和厚垣孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的分生孢子為材料，采用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)對(duì)供試材料的基因組DNA進(jìn)行甲基化分析，旨在探究稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子DNA甲基化的水平和模式，這有利于揭示稻曲病菌厚垣孢子休眠分子機(jī)制，對(duì)探究真核生物分子休眠機(jī)制具有一定的理論價(jià)值。

1材料與方法

1.1供試病菌

從高感稻曲病水稻品種‘紅蓮優(yōu)6號(hào)采集病粒稻曲球，分離稻曲病菌的單孢，用燕麥培養(yǎng)基（燕麥片30 g，瓊脂20 g，水加至1 000 mL）培養(yǎng)。并用PS培養(yǎng)液（馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）在水平搖床上26℃黑暗條件下130 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)獲得分生孢子。在無(wú)菌環(huán)境下將分生孢子懸浮液與搗碎的菌絲片段混勻，孢子濃度調(diào)至4×105個(gè)/mL并接種到水稻品種‘紅蓮優(yōu)6號(hào)上，發(fā)病后收集黃色、黑色的稻曲病菌厚垣孢子。將獲得的孢子保存于-80℃冰箱備用。

1.2供試試劑

基因組DNA提取試劑盒，OMG公司。EcoRⅠ、MspⅠ、Hpa Ⅱ、10×Buffer T等，紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司?；蚪MDNA接頭的連接試劑（T4 DNA Ligase，基因組DNA的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增試劑）等，北京全式金生物技術(shù)有限公司;電泳及銀染試劑為國(guó)產(chǎn);EcoRⅠ接頭、HpaⅡ-MspⅠ接頭、擴(kuò)增引物等，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物及接頭序列見表1。

1.3基因組DNA的提取

采用基因組DNA提取試劑盒分別提取稻曲病菌的分生孢子、黃色和黑色厚垣孢子基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒上的說(shuō)明。并用核酸分析儀測(cè)定260 nm、280 nm時(shí)的吸光度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.4基因組DNA的甲基化MSAP體系建立

1.4.1基因組DNA的雙酶切

分別使用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ/Hpa Ⅱ和EcoR Ⅰ/Msp Ⅰ對(duì) DNA 進(jìn)行雙酶切。將提取的DNA （500 ng） 5.0 μL，EcoRⅠ（20 U/μL）0.5 μL，MspⅠ（或HpaⅡ）（20 U/μL）0.5 μL，10×Buffer T 2.5 μL，加水至25 μL，混勻后于低溫恒溫水浴槽37℃酶切保溫12 h，65℃溫育20 min，4℃保存。

1.4.2基因組DNA接頭的準(zhǔn)備與連接

將EcoRⅠ接頭引物分別配成15 μmol/L 的保存液，混合稀釋成5 μmol/L;HpaⅡMspⅠ接頭引物分別配成100 μmol/L的保存液，混合配成50 μmol/L?；旌暇鶆蚝笾糜赑CR儀：65℃ 10 min;37℃ 10 min;25℃ 10 min，然后自然冷卻至室溫。將酶切產(chǎn)物8.5 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，5×T4 DNA Ligase Buffer 4.0 μL，EcoR Ⅰadapter （5 μmol/L） 2.0 μL，Hpa ⅡMsp Ⅰadapter （50 μmol/L）2.0 μL，補(bǔ)水至20 μL，混勻后于低溫恒溫水浴槽16℃培養(yǎng)過(guò)夜，70℃滅活10 min，-20℃保存。

1.4.3基因組DNA的預(yù)擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增總體積25 μL，包括連接產(chǎn)物2.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L預(yù)擴(kuò)增上下游引物各1.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.4.4基因組DNA的選擇性擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物20倍稀釋液5.0 μL，10×Trans Tap HiFi Buffer 2.5 μL，Trans Tap HiFi DNA Polymerase 0.5 μL，GC Enhancer 0.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L選擇性上下游引物各15 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 30 s，65℃（每個(gè)循環(huán)降低0.7℃）30 min，72℃ 1 min，13個(gè)循環(huán);94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，23個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.4.56%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用美國(guó)BIORAD 公司的PowerPac HV電泳儀，恒定電壓1 800 V進(jìn)行預(yù)電泳30 min，使凝膠預(yù)熱。然后上樣，1 200 V電泳2.0～2.5 h，待二甲苯青移動(dòng)至整個(gè)凝膠的2/3處時(shí)，停止電泳，取出凝膠，銀染顯色。

1.5數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)顯影后的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶，將清晰條帶顯示記為“1”，無(wú)條帶顯示處記為“0”，記錄所有適宜選擴(kuò)增引物組合的MSAP圖譜，組成二次元矩陣， 進(jìn)行甲基化多態(tài)性統(tǒng)計(jì)[25]。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA的選擇性擴(kuò)增

甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）中使用的內(nèi)切酶MspⅠ和HpaⅡ是一組同裂酶，都識(shí)別并切割5′CCGG3′序列，但在5′CCGG3′存在甲基化時(shí)，兩種酶對(duì)該序列不同甲基化狀態(tài)的敏感度不同。MspⅠ只能切割外部胞嘧啶沒有發(fā)生甲基化的5′CCGG3′序列，一旦外部胞嘧啶發(fā)生甲基化，將不能切割此位點(diǎn)。HpaⅡ?qū)Π爰谆▎捂溂谆┟舾校瑢?duì)全甲基化（雙鏈甲基化）不敏感，只切割半甲基化的5′CCGG3′序列。

因此，聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的條帶可分為4種類型：Ⅰ型，兩條泳道均有帶，表示無(wú)甲基化或單鏈內(nèi)部發(fā)生甲基化;Ⅱ型，MspⅠ酶切產(chǎn)物擴(kuò)增泳道有帶，HpaⅡ酶切產(chǎn)物擴(kuò)增泳道無(wú)帶，表示發(fā)生雙鏈內(nèi)部甲基化;Ⅲ型，HpaⅡ酶切產(chǎn)物擴(kuò)增泳道有帶，MspⅠ酶切產(chǎn)物擴(kuò)增泳道無(wú)帶，表示發(fā)生單鏈外部甲基化;Ⅳ型，不存在CCGG位點(diǎn)，或內(nèi)側(cè)和外側(cè)胞嘧啶同時(shí)甲基化（圖1）。據(jù)報(bào)道[2627]，第四種甲基化類型的頻率很低，因此我們得到的甲基化水平可能只比實(shí)際的低一些。

2.2基因組DNA甲基化水平和模式

EcoR Ⅰ選擇性擴(kuò)增引物分別與Msp Ⅰ、Hpa Ⅱ選擇性擴(kuò)增引物配對(duì)，從120對(duì)MSAP選擇性擴(kuò)增引物中篩選出28對(duì)擴(kuò)增圖譜清晰、甲基化多態(tài)性豐富、條帶重復(fù)性好的選擇性擴(kuò)增引物組合。采用2.1的帶型統(tǒng)計(jì)方法記錄PAGE膠上的擴(kuò)增條帶，結(jié)果如表2所示。

根據(jù)對(duì)稻曲病菌的分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子基因組DNA進(jìn)行MSAP分析，可以看出分生孢子基因組DNA中CCGG序列的甲基化率為20.56%，黑色厚垣孢子為25.63%，黃色厚垣孢子為33.52%。其中分生孢子DNA的甲基化率最低，黃色厚垣孢子DNA的甲基化率最高。

在分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子DNA的擴(kuò)增條帶中，全甲基化條帶數(shù)分別為135、116、154條，全甲基化率分別為8.73%、13.96%、17.68%，分生孢子全甲基化率低于半甲基化率，黑色和黃色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看出DNA甲基化在稻曲病菌休眠與非休眠厚垣孢子中發(fā)生普遍，在稻曲病菌分生孢子和厚垣孢子之間，基因組DNA甲基化水平差異明顯，黃色和黑色的厚垣孢子主要是全甲基化模式，分生孢子則是以半甲基化模式為主。

3討論

MSAP （甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性） 技術(shù)是檢測(cè)基因組DNA甲基化的重要方法之一，它是在AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)MspⅠ和HpaⅡ?qū)谆舾行缘牟煌瑏?lái)區(qū)分基因組DNA全甲基化和半甲基化狀態(tài)，同時(shí)可以測(cè)出其總甲基化水平[28]。

稻曲病菌引起水稻穗粒發(fā)病，在穗粒上形成稻曲球，稻曲球中的孢子座產(chǎn)生粉狀厚垣孢子，厚垣孢子在發(fā)育過(guò)程中其顏色會(huì)發(fā)生變化，由乳白色逐漸變成黃色，最終成為墨綠色（黑色），即厚垣孢子由非休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化成休眠狀態(tài)，這種現(xiàn)象屬于表觀遺傳特征。厚垣孢子在非休眠和休眠的轉(zhuǎn)換中，其表觀遺傳上有明顯差異，這種差異與DNA甲基化相關(guān)。本研究采用MSAP技術(shù)，以稻曲病菌的分生孢子及兩種顏色的厚垣孢子為材料，初次對(duì)稻曲病菌分生孢子、休眠與非休眠厚垣孢子的基因組DNA甲基化水平和模式進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，稻曲病菌分生孢子、黑色和黃色厚垣孢子DNA甲基化水平差異明顯，休眠的黑色厚垣孢子的甲基化要低于非休眠的黃色厚垣孢子。這個(gè)結(jié)論與種子萌發(fā)甲基化水平變化是相似的，黃韞宇等[29]用NaCl處理黃瓜種子，發(fā)現(xiàn)黃瓜種子在萌發(fā)過(guò)程中甲基化水平是不斷變化的，前期甲基化水平略高，中后期甲基化水平降低，發(fā)芽末期甲基化水平更低，與Mishra等[30]報(bào)道的比較一致， Candida albicans 是人類真菌性病原物，其DNA甲基化調(diào)控影響的基因通常與形態(tài)轉(zhuǎn)化，如酵母態(tài)與菌絲態(tài)形態(tài)轉(zhuǎn)換、白色細(xì)胞與非透明細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及鐵離子代謝相關(guān)的基因有關(guān)。C. albicans在無(wú)性生長(zhǎng)期間，被壓制轉(zhuǎn)錄甲基化位點(diǎn)中C轉(zhuǎn)換成T 的頻率提高，一個(gè)進(jìn)化上穩(wěn)定的抑制突變的模式可能會(huì)因?yàn)榄h(huán)境或寄主變化而發(fā)生遺傳改變。稻曲病菌的3種不同發(fā)育時(shí)期的孢子的DNA甲基化調(diào)控的基因可能影響其萌發(fā)，利用MSAP方法獲得稻曲病菌3種孢子的甲基化差異性位點(diǎn)的DNA片段，通過(guò)克隆測(cè)序可獲得相應(yīng)的基因的重要信息，從而可找到甲基化差異基因的表達(dá)與休眠的相關(guān)性。另外，通過(guò)分析甲基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)全甲基化，即雙鏈甲基化是稻曲病菌休眠與非休眠基因組DNA甲基化的主要模式，分生孢子DNA則表現(xiàn)為全甲基化率低于半甲基化率，以半甲基化為主要模式;黑色和黃色厚垣孢子的全甲基化率均高于半甲基化率。此結(jié)論與種子萌發(fā)中，大量基因上調(diào)表達(dá)相一致，且種子萌發(fā)過(guò)程中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)少量的甲基化事件，說(shuō)明部分功能基因處于關(guān)閉或正在關(guān)閉的調(diào)控狀態(tài)[3134]。稻曲病菌由可萌發(fā)的黃色厚垣孢子到不可萌發(fā)的黑色厚垣孢子，由厚垣孢子到萌發(fā)后的分生孢子之間的胞嘧啶甲基化率降低、甲基化模式改變，其分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]TAKETO A， MAMI T， JOUJI M， et al. A refined inoculation method to evaluate false smut resistance in rice [J].Journal of General Plant Pathology，2011，77：1016.

[2]王金輝，陳越華.湖南省2004年中、晚稻稻曲病流行情況調(diào)查[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2005，25（8）：1415.

[3]姜慎，唐春生，譚志瓊.國(guó)內(nèi)外稻曲病研究現(xiàn)狀[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，30（3）：6266.

[4]鄧根生.國(guó)內(nèi)稻曲病研究現(xiàn)狀[J].植物保護(hù)，1989，15（6）：3940.

[5]呂世瓊，劉浩，趙江林，等.稻曲菌素研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（14）：265268.

[6]SUN Xianyun， KANG Shu， ZHANG Yongjie， et al. Genetic diversity and population structure of rice pathogen Ustilaginoidea virens in China [J/OL].PLoS ONE，2013，8（9）：e76879.

[7]GUO Xiaoyi， LI Yan， FAN Jing， et al. Progress in the study of false smut disease in Rice [J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2012：12111217.

[8]劉安國(guó)，何念杰，汪金蓮.稻曲病菌[Ustilaginoidea virens （Cooke） Takahashi]厚垣孢子發(fā)芽力的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，11（3）：2934.

[9]王疏，白元俊，周永力，等.稻曲病菌的病原學(xué)[J].植物病理學(xué)報(bào)，1998，28（1）：1924.

[10]王國(guó)良.稻曲病菌厚垣孢子侵染時(shí)期和侵染途徑的研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1992，19（2）：97100.

[11]陸凡，陳志誼，陳毓苓，等.稻曲病菌的生物學(xué)特性及其侵染循環(huán)中某些未確定要點(diǎn)的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1996，12（4）：3540.

[12]左廣勝，冉西京，杜生茂，等.稻曲病菌初侵染源研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，1996，12（5）：1718.

[13]SCHAEFER C B， OOI S K T， BESTOR T H， et al. Epigenetic decisions in mammalian germ cells [J]. Science， 2007， 316： 398399.

[14]REIK W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development [J].Nature，2007，447： 425432.

[15]TAMAME M， ANTEQUERA F， VILLANUEVA J R， et al. Highfrequency conversion to a “fluffy” developmental phenotype in Aspergillus spp. by 5azacytidine treatment： evidence for involvement of a single nuclear gene [J]. Molecular and Cellular Biology， 1983， 3（12）： 22872297.

[16]ANTEQUERA F， TAMAME M， VILLANUEVA J R， et al. DNA methylation in the fungi [J]. The Journal of Biological Chemistry， 1984， 259（13）： 80338036.

[17]DHILLON B， CAVALETTO J R， WOOD K V， et al. Accidental amplification and inactivation of a methyltransferase gene eliminates cytosine methylation in Mycosphaerella graminicola [J]. Genetics， 2010， 186： 6777.

[18]LIU Siyang， LIN Jianqing， WU Honglong， et al. Bisulfite sequencing reveals that Aspergillus flavus holds a hollow in DNA methylation [J/OL]. PLoS ONE， 2012， 7（1）： e30349.

[19]ZEMACH A， MCDANIEL I E， SILVA P， et al. Genomewide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation [J]. Science， 2010， 328： 916919.

[20]HONDA S， LEWIS Z A， HUARTE M， et al. The DMM complex prevents spreading of DNA methylation from transposons to nearby genes in Neurospora crassa [J]. Genes & Development， 2010， 24（5）： 443454.

[21]LEWIS Z A， ADHVARYU K K， HONDA S， et al. DNA methylation and normal chromosome behavior in Neurospora depend on five components of a histone methyltransferase complex， DCDC [J/OL].PLoS Genetics，2010，6（11）： e1001196.

[22]REYNALOPEZ G E， SIMPSON J， RUIZHERRERA J. Differences in DNA methylation patterns are detectable during the dimorphic transition of fungi by amplification of restriction polymorphism [J].Molecular Genetics and Genomics，1997，253：703710.

[23]IKEDA K， VAN VU B， KADOTANI N， et al. Is the fungus Magnaporthe losing DNA methylation？[J]. Genetics， 2013， 195： 845855.

[24]JEON J， CHOI J， LEE G W， et al. Genomewide profiling of DNA methylation provides insights into epigenetic regulation of fungal development in a plant pathogenic fungus， Magnaporthe oryzae [J]. Scientific Reports， 2015， 5：8567.

[25]JAROSLAV F， ALES K. How to interpret methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP） profiles？[J]. BMC Genetics， 2014， 15：2. DOI： 10.1186/1471 2156152.

[26]NAKAYASHIKI H， IKEDA K， HASHIMOTO Y， et al. Methylation is not the main force repressing the retrotransposon MAGGY in Magnaporthe grisea[J]. Nucleic Acids Research， 2001， 29（6）： 12781284.

[27]SALMON A， AINOUCHE M L， WENDEL J F，et al. Genetic and epigenetic consequences of recent hybridization and polyploidy in Spartina （Poaceae） [J].Molecular Ecology，2005，14：11631175.

[28]李衛(wèi)國(guó)， 常天俊， 龔紅梅. MSAP技術(shù)及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)， 2008， 18（1）： 8387.

[29]黃韞宇， 張海軍， 邢燕霞， 等. NaCl 脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響及DNA甲基化的MSAP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46（8）：16461656.

[30]MISHRA P K， BAUM M， CARBON J. DNA methylation regulates phenotypedependent transcriptional activity in Candida albicans [J]. PNAS， 2011， 108（29）： 1196511970.

[31]褚會(huì)娟， 張今今， 王喆， 等. 丹參MSAP分子標(biāo)記技術(shù)體系的優(yōu)化及其應(yīng)用[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2011（5）： 920928.

[32]SANTOS D， FEVERIRO P. Loss of DNA methylation affects somatic embryogenesis in Medicago truncatula [J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002，70（2）：155161.

[33]XIA Ran， WANG Junguo， LIU Chunyan， et al. ROR1/RPA2A， a putative replication protein A2， functions in epigenetic gene silencing and in regulation of meristem development in Arabidopsis [J].The Plant Cell，2006，18（1）：85103.

[34]叢建民， 陳鳳清， 沈海龍， 等. 水曲柳胚后熟時(shí)期MSAP分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 39（3）： 3944.

（責(zé)任編輯：楊明麗）