王威 孫克

世界范圍內(nèi)，前列腺癌(prostate cancer，PCa)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在一些歐美國(guó)家甚至常年高居男性惡性腫瘤發(fā)病率第一位[1]。近年來(lái)，由于人口老齡化的加劇、生活習(xí)性的變化和飲食結(jié)構(gòu)的改變等因素，我國(guó)PCa的發(fā)病率也呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)[2-3]。相較歐美國(guó)家，雖然我國(guó)PCa的發(fā)病率較低，但PCa患者的分期構(gòu)成卻遠(yuǎn)不及歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，且差別巨大。美國(guó)確診的新發(fā)PCa病例中臨床局限型PCa所占比例接近81.0%，其一線治療為根治性手術(shù)或根治性放療，通常預(yù)后良好，5年生存率高達(dá)90.0%[4]。我國(guó)確診的新發(fā)PCa病例中臨床局限型患者的比例僅為30.0%，意味著約70.0%的PCa患者為局部晚期或已發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，這部分患者無(wú)法接受局部根治性治療，且預(yù)后較差[5]。因此，更加早期的確診和及時(shí)治療是改善我國(guó)PCa患者預(yù)后的重要手段與有效途徑。如何在一般人群中篩查出事實(shí)上已患癌癥的患者是擺在我們面前的首要問(wèn)題。研究證實(shí)，細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)釋放腫瘤內(nèi)源性miRNA進(jìn)入外周循環(huán)，與體內(nèi)靶基因mRNA3’結(jié)合，誘導(dǎo)miRNA靶基因降解，因此理論上外周血游離miRNA能夠用于腫瘤的診斷與預(yù)后[6-7]。miR-21和miR-135均具有調(diào)控PCa細(xì)胞增殖的作用，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PCa患者血清中miR-21和miR-135的表達(dá)水平，分析其與PCa的相關(guān)性，以期為PCa的診斷與預(yù)后提供新的參考指標(biāo)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、一般資料

選取2016年8月至2018年6月我院收治并經(jīng)病理活檢確診的PCa患者、良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)患者和同時(shí)期體檢正常的健康人群各80例，分別納入PCa組、BPH組和健康組。PCa組、BPH組和健康組平均年齡分別為(58.23±5.42)、(57.51±5.21)和(56.83±6.03)歲，3組的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性(P>0.05)。所有受試者均排除糖尿病、心腦血管疾病、其他惡性腫瘤、精神疾病及肝腎功能不全等有可能影響研究均衡性的疾病。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，受試者自愿簽署知情同意書(shū)。

二、研究方法

1.病理分級(jí)：依據(jù)WHO根據(jù)腺體分化程度于2003年制定的Gleason評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]：評(píng)分2～4分代表腺體形態(tài)完好的高分化腺癌；評(píng)分5～7分代表腺體伴有少量發(fā)育不全或融合成篩狀的中分化腺癌；評(píng)分8～10分代表發(fā)育不全，融合成篩狀腺體或腺體結(jié)構(gòu)缺乏，并伴壞死的低分化或未分化腺癌。根據(jù)PCa臨床病理統(tǒng)計(jì)分析資料，本研究認(rèn)為Gleason評(píng)分>7分意味著癌腫分化程度差，并伴有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和壞死，且存在明顯染色變化。

2.RNA提?。翰捎胢irVanaTMPARISTMmiRNA試劑盒(上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn))對(duì)保存在-80 ℃的血清標(biāo)本進(jìn)行RNA提取和濃度測(cè)定。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定：提取的1 μg總RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)miR-21和miR-135基因的表達(dá)進(jìn)行定量。miR-21基因的PCR反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s；72 ℃ 20 s。miR-135基因的PCR反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min。以上操作均在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，所有反應(yīng)均重復(fù)3次[9]，然后進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)水平的計(jì)算。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組血清miR-21和miR-135的表達(dá)水平比較

PCa組miR-21和miR-135的表達(dá)水平均明顯高于BPH組和健康組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；BPH組和健康組間miR-21和miR-135的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組血清miR-21和miR-135表達(dá)水平比較

與PCa組比較aP<0.05；與BPH組比較bP>0.05

二、PCa組miR-21和miR-135表達(dá)水平與病理分級(jí)的相關(guān)性

依據(jù)PCa病理分級(jí)將PCa組分為Gleason評(píng)分>7分組和≤7分組，結(jié)果顯示Gleason評(píng)分>7分的PCa患者血清miR-21和miR-135表達(dá)水平明顯高于Gleason評(píng)分≤7分的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PCa組miR-21和miR-135表達(dá)水平與病理分級(jí)的相關(guān)性

討 論

我國(guó)PCa發(fā)病率在近20年間增長(zhǎng)超過(guò)10倍；從當(dāng)前中國(guó)老齡化和飲食發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，其發(fā)病率還將繼續(xù)上升[10]。2015年中國(guó)腫瘤年報(bào)報(bào)道，我國(guó)男性發(fā)病率升高的6種癌癥中就包括PCa，其已經(jīng)上升至男性惡性腫瘤的第6位[11]。PCa的發(fā)病原因尚未完全明確，其與內(nèi)分泌因子關(guān)系復(fù)雜，且與患者的生活方式息息相關(guān)[12]。借鑒歐美國(guó)家PCa的篩查經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合我國(guó)PCa的診療現(xiàn)狀，中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)泌尿男生殖腫瘤專業(yè)委員會(huì)前列腺癌學(xué)組的二十余位專家于2017年5月對(duì)前列腺癌篩查相關(guān)問(wèn)題達(dá)成共識(shí)[3]，致力于改善我國(guó)初診PCa患者分期偏晚期和PCa患者預(yù)后較差的臨床現(xiàn)狀。

特異度和敏感度相對(duì)較高且方便、廉價(jià)的檢查手段是適用于任何疾病包括腫瘤篩查的先決條件，PCa篩查也不例外。PCa發(fā)病隱匿，早期確診、盡早治療顯得尤為重要。目前臨床上最為常用的PCa診斷方法主要包括直腸指檢、血清PSA檢查和盆腔MRI。經(jīng)濟(jì)、安全的直腸指檢既往被諸多指南和共識(shí)推薦為PCa的篩查手段，但其存在PCa早期診斷價(jià)值低、篩查試驗(yàn)敏感度不理想、受醫(yī)師個(gè)人經(jīng)驗(yàn)和主觀因素影響大等缺點(diǎn)。單憑直腸指檢篩查只能發(fā)現(xiàn)2.0%左右的PCa患者，且發(fā)現(xiàn)的患者中48.0%～85.0%已發(fā)生前列腺外侵犯，喪失了早期診治的意義[13]。目前血清PSA雖然是PCa診斷的重要標(biāo)志物，但是否將其作為PCa篩查的常規(guī)手段，學(xué)術(shù)界一直存在著巨大的分歧。由于PSA是組織特異性抗原而非腫瘤特異性抗原，所以惡性腫瘤、BPH、前列腺炎、前列腺梗死、射精、直腸指檢和尿路感染等諸多因素都可導(dǎo)致其異常升高，因此血清PSA檢查對(duì)PCa診斷的特異性并不理想。MRI檢查耗時(shí)較長(zhǎng)、費(fèi)用高昂、檢查不便利，僅適用于發(fā)現(xiàn)異常而需要進(jìn)一步進(jìn)行診斷性檢查的人群。

近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，miRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用逐漸被大家認(rèn)知[14]。人體內(nèi)的miRNA為長(zhǎng)度僅22 nt的內(nèi)源性表達(dá)的微小單鏈RNA，其對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，在細(xì)胞增殖與凋亡中的作用舉足輕重[15]。miRNA能夠通過(guò)結(jié)合體內(nèi)靶基因mRNA3’端非翻譯區(qū)(3′-UTR)，從而抑制miRNA靶基因翻譯，誘導(dǎo)其降解，因此miRNA靶基因在機(jī)體中具有促癌或抑癌的功能[16]。

PCa患者腫瘤細(xì)胞的變異增殖需要激活促癌基因，miRNA促癌功能的發(fā)揮導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖增加而凋亡減少，促進(jìn)惡性腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展[17]。本研究中miR-21和miR-135在PCa患者、BPH患者和健康人群的血清中的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的不同，兩項(xiàng)指標(biāo)在PCa組的表達(dá)均顯著高于BPH組和健康組(P<0.05)，但BPH組和健康組的差異并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這說(shuō)明miR-21和miR-135檢測(cè)不僅可以對(duì)PCa進(jìn)行篩查，而且可以對(duì)PCa和BPH進(jìn)行初步鑒別診斷。相較于Gleason評(píng)分≤7分的PCa患者，Gleason評(píng)分>7分的患者血清中miR-21和miR-135的表達(dá)水平也有顯著增高，進(jìn)一步說(shuō)明這兩項(xiàng)指標(biāo)對(duì)評(píng)估PCa患者的預(yù)后具有參考意義。

綜上所述，我們認(rèn)為miR-21和miR-135在PCa患者血清中呈高表達(dá)，可作為PCa篩查、輔助診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。