劉萍 鞏棟 張利平 席春生

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于腎小管上皮系統(tǒng)最常見(jiàn)的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤，其中超過(guò)75%是腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)[1]。RCC對(duì)放化療不敏感，早期RCC的主要治療措施是手術(shù)切除。在過(guò)去十年中，隨著外科手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)和特定靶向藥物的應(yīng)用，RCC患者的生存率顯著改善[2]。然而，由于RCC早期癥狀隱匿，其早期準(zhǔn)確診斷仍面臨巨大的挑戰(zhàn)，約三分之一的患者確診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而無(wú)法手術(shù)，即使早期可手術(shù)切除的患者仍有三分之一會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)[3-4]，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)后的治療方法有限且效果不佳。因此，篩選與ccRCC相關(guān)的基因并了解其表達(dá)情況，對(duì)ccRCC診斷和預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，可以被劃分為6個(gè)類型：第一類(視紫紅質(zhì)樣受體)、第二類(分泌素受體家族)、第三類(代謝型谷氨酸受體)、第四類(真菌交配信息素受體)、第五類(環(huán)腺苷酸受體)、第六類(Frizzled/Smoothened家族)，分屬其中的GPCRs的基因序列之間沒(méi)有同源關(guān)系[5]。甲狀旁腺激素1受體(parathyroid hormone 1 receptor,PTH1R)屬于第二類GPCRs家族。甲狀旁腺激素是血液中鈣和磷酸鹽濃度最重要的調(diào)節(jié)劑，甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related peptide,PTHrP)是一種與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控相關(guān)的生長(zhǎng)因子，同時(shí)被認(rèn)為是引起惡性腫瘤體液性高鈣血癥的最常見(jiàn)原因，PTH1R是PTHrP的常見(jiàn)受體，PTHrP與PTH1R在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌中PTH1R低表達(dá)與腫瘤大小、Edmondson分級(jí)、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)水平和總體生存率相關(guān)，PTH1R低表達(dá)提示肝細(xì)胞癌預(yù)后不良[6]。本文利用Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析PTH1R在ccRCC中的表達(dá)及其和預(yù)后的關(guān)系，通過(guò)二次分析薈萃PTH1R和ccRCC可能存在的關(guān)系，為進(jìn)一步研究PTH1R在ccRCC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索和依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析

Oncomine是發(fā)展成熟的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，主要挖掘腫瘤基因信息。到目前為止，該數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收集了19種類型的癌癥，700多個(gè)腫瘤芯片數(shù)據(jù)，90 000多個(gè)癌癥組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)，目前仍在不斷發(fā)展中[7]。Oncomine可用于比較不同基因在癌癥和各自正常組織的差異表達(dá)分析，也可以用于挖掘癌癥不同亞型與預(yù)后的關(guān)系。本研究首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘ccRCC中低表達(dá)的基因，篩選出PTH1R后，再次設(shè)定需要篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件，搜索條件：gene:PTH1R;cancer type:clear cell renal cell carcinoma；data type:mRNA and DNA；analysis type:cancer vs normal analysis。

二、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)是由北京大學(xué)研發(fā)的用于比較基因在正常和腫瘤組織中表達(dá)差異的應(yīng)用數(shù)據(jù)庫(kù)，包括來(lái)自TCGA和GTEx的9 000多個(gè)腫瘤樣本和8 000多個(gè)正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)，包括了33種惡性腫瘤[8]。GEPIA功能還包含不同腫瘤類型或病理階段的分析、生存分析、相關(guān)性分析和降維分析等多種分析模塊。本研究使用TCGA來(lái)源數(shù)據(jù)[9]，GEPIA可以與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)相互驗(yàn)證基因在組織中的表達(dá)，同時(shí)可以分析PTH1R基因表達(dá)水平與病理分期及預(yù)后生存的關(guān)系。

三、MethHc數(shù)據(jù)庫(kù)分析

MethHc數(shù)據(jù)庫(kù)是包括正常組織和腫瘤的DNA甲基化和mRNA/microRNA基因表達(dá)的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含18種人類腫瘤中6 000多個(gè)樣本、6 548個(gè)微陣列和12 567個(gè)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)可以幫助研究人員識(shí)別對(duì)致癌作用很重要的表觀遺傳模式。使用MethHc數(shù)據(jù)庫(kù)可以區(qū)分基因甲基化水平在正常組織和腫瘤中的差異以及基因甲基化的主要區(qū)域[10]。在MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇“KIRC”(ccRCC)，在“gene search”中輸入“PTH1R”，“gene region”中選擇“promoter”。

結(jié) 果

一、Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中ccRCC的低表達(dá)基因

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中符合設(shè)定篩選條件的有9個(gè)子數(shù)據(jù)集(圖1)。比較分析9個(gè)子數(shù)據(jù)集，得出PTH1R基因在ccRCC中較正常腎組織低表達(dá)，但目前尚沒(méi)有薈萃分析ccRCC中PTH1R基因表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的相關(guān)文獻(xiàn)，故本文選擇PTH1R基因。

圖1 ccRCC中低表達(dá)的基因

二、Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中PTH1R在ccRCC中的表達(dá)結(jié)果

挖掘Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，自2003年開(kāi)始，關(guān)于PTH1R在ccRCC和正常腎組織中表達(dá)的研究共有8個(gè)(圖2)，文章分別發(fā)表于《Cancer Research》、《BMC Cancer》和《Clinical Cancer Research》。分析8個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTH1R在所有表達(dá)差異基因中的中位秩為98.5，P=7.53E-10，提示PTH1R在ccRCC中低表達(dá)。

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TCGA來(lái)源的623個(gè)樣本，其中包括正常腎組織100個(gè)樣本，ccRCC 523個(gè)樣本，發(fā)現(xiàn)PTH1R在ccRCC中的表達(dá)明顯低于正常腎組織(圖3)，與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果相互驗(yàn)證。

圖2 PTH1R在ccRCC中的表達(dá)(Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù))

圖3 PTH1R在ccRCC和正常組織中的表達(dá)(TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))

三、不同研究子數(shù)據(jù)集中ccRCC和正常腎組織PTH1R表達(dá)的差異

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中，不同研究子數(shù)據(jù)集中ccRCC與正常腎組織中PTH1R表達(dá)的結(jié)果見(jiàn)圖4。分別包括在Gumz Renal、Jones Renal、Lenburg Renal和Yusenko Renal等4個(gè)子數(shù)據(jù)集中，PTHIR在ccRCC中的表達(dá)顯著低于正常腎組織。

A:Gumz Renal研究中PTH1R在正常腎組織和ccRCC中的表達(dá)情況；B:Jones Renal研究中PTH1R在正常腎組織和ccRCC中的表達(dá)情況；C:Lenburg Renal研究中PTH1R在正常腎組織和ccRCC中的表達(dá)情況；D:Yusenko Renal研究中PTH1R在正常腎組織和ccRCC中的表達(dá)情況圖4 不同數(shù)據(jù)集中PTH1R在正常腎組織和ccRCC中的表達(dá)情況

四、PTH1R表達(dá)水平與ccRCC病理分期的關(guān)系

使用GEPIA分析PTH1R表達(dá)水平與ccRCC病理分期的關(guān)系。選擇TCGA來(lái)源的ccRCC(KIRC)數(shù)據(jù)，如圖5所示，病理分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分別代表高、中、低與未分化，分期越高代表腫瘤進(jìn)展越快，PTH1R水平越低(P=0.000 000 003 01)。

五、ccRCC中PTH1R基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平

在MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示PTH1R的甲基化轉(zhuǎn)錄模板NM-000316，PTH1R在ccRCC中的甲基化水平比正常腎組織顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；在ccRCC中PTH1R的甲基化主要位于啟動(dòng)子區(qū)域。見(jiàn)圖6。

圖5 PTH1R在不同病理分期ccRCC中的表達(dá)水平

A:ccRCC和正常腎組織甲基化水平比較；B：ccRCC中PTH1R啟動(dòng)子區(qū)域甲基化表達(dá)圖6 PTH1R啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平

六、PTH1R表達(dá)水平與ccRCC患者預(yù)后的關(guān)系

在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析PTH1R表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。在TCGA來(lái)源的GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，得出ccRCC(KIRC)PTH1R基因高表達(dá)與低表達(dá)患者各258例的總體生存曲線(圖7A)，發(fā)現(xiàn)在ccRCC中PTH1R低表達(dá)患者的總生存率明顯低于高表達(dá)患者，PTH1R低表達(dá)提示ccRCC預(yù)后不良(Log-rank，P=0.000 036)。其中HR=0.52，P(HR)=4.8e-05。PTH1R低表達(dá)者無(wú)病生存期明顯低于高表達(dá)者(Log-rank，P=0.000 014)。其中HR=0.44，P(HR)=2.5e-05(圖7B)。

A：PTH1R表達(dá)與總生存率的相關(guān)性；B：PTH1R表達(dá)與無(wú)病生存期的相關(guān)性圖7 PTH1R表達(dá)水平與ccRCC總生存率和無(wú)病生存期的相關(guān)性

討 論

RCC是最常見(jiàn)的腎實(shí)質(zhì)惡性腫瘤，占成年人惡性腫瘤的3%～5%[11]。目前臨床上主要采取腎切除術(shù)治療RCC，但其復(fù)發(fā)率高，治療效果不佳，經(jīng)過(guò)積極治療，5年存活率還不到10%[12]。盡管目前分子靶向治療取得一定效果，但僅有20%～40%的患者對(duì)靶向治療藥物敏感，高風(fēng)險(xiǎn)RCC患者對(duì)靶向藥物無(wú)明顯效果[13]。因此急需研究ccRCC在分子水平的改變，尋找ccRCC發(fā)生、發(fā)展的原因并進(jìn)行針對(duì)性的治療具有重要意義。

PTH1R在腎臟中主要位于近端和遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞的基底外側(cè)質(zhì)膜上。PTH1R也存在于結(jié)直腸癌、前列腺癌、RCC和骨肉瘤等腫瘤組織中[14]。在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，PTH1R高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移，提示預(yù)后不良[15]；另有研究發(fā)現(xiàn)在大鼠骨肉瘤模型中敲除PTH1R基因可以減少骨肉瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲[16]。然而在肺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)PTHrP與PTH1R相結(jié)合由環(huán)磷酸腺苷作為第二信使介導(dǎo)抑制肺癌細(xì)胞增殖，敲除PTH1R基因后，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞增殖[17]。我們通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織相比，PTH1R在ccRCC中低表達(dá)，并且低表達(dá)的患者總體生存率明顯低于高表達(dá)患者，PTH1R低表達(dá)者無(wú)病生存期明顯低于高表達(dá)者。分析PTH1R表達(dá)水平與ccRCC病理分期的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，PTH1R水平越低，其病理分期越高，腫瘤進(jìn)展越快，提示預(yù)后不良。我們又用MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)分析ccRCC和正常腎組織中PTH1R基因的甲基化水平，結(jié)果顯示在ccRCC中PTH1R基因的甲基化水平比正常腎組織高，我們猜測(cè)PTH1R基因甲基化水平升高可能在ccRCC的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。PTH1R基因在ccRCC中的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌相似，與正常組織相比，PTH1R在肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，PTH1R低表達(dá)可能是肝細(xì)胞癌高鈣血癥的主要原因，PTH1R低表達(dá)與腫瘤大小、肝癌Edmondson分級(jí)、血清AFP水平和總體生存率相關(guān)[6]。目前PTH1R在ccRCC中低表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)的機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)探究。

綜上所述，本研究應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行大樣本分析獲得ccRCC相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)PTH1R在ccRCC組織中低表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)，發(fā)現(xiàn)了新的預(yù)后指標(biāo)，為ccRCC預(yù)后評(píng)估分子靶標(biāo)的開(kāi)發(fā)提供了新的理論依據(jù)。但本研究是基于數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，尚有一定的局限性，仍需要通過(guò)分析臨床腫瘤大樣本PTH1R表達(dá)以明確其是否可以作為臨床預(yù)后的生物標(biāo)志物，同時(shí)進(jìn)一步研究其在ccRCC發(fā)生機(jī)制中的作用，為腫瘤藥物的研發(fā)提供重要的依據(jù)。