王章存，袁路陽，張 露，胡金強(qiáng)，安廣杰，趙學(xué)偉

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

大豆蛋白是最重要的植物蛋白來源，具有蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成合理等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1-2]。然而，大豆被公認(rèn)為世界“八大”過敏原之一[3]，目前已從大豆中確認(rèn)出38 種蛋白質(zhì)具有抗原性，其中大豆中的主要儲(chǔ)藏蛋白β-伴大豆球蛋白（7S）和大豆球蛋白（11S）是主要的抗原性蛋白[4]。大豆導(dǎo)致的主要癥狀表現(xiàn)為胃部不適或過敏性皮炎，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致人體和動(dòng)物毛細(xì)血管滲透性增加、腹瀉等，嚴(yán)重影響人體健康[5-6]。在世界范圍內(nèi)均對大豆蛋白的抗原性給予高度重視。

食品加工中最常用加熱處理并不能有效消除大豆蛋白的抗原性，其原因是加熱處理僅能破壞其構(gòu)象型抗原表位（又稱抗原決定簇），很難破壞其序列型抗原表位[7]。酶解處理不僅可破壞蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，也可水解序列型抗原表位，能有效降低甚至消除蛋白質(zhì)的抗原性。近年來國內(nèi)外對此進(jìn)行了較多研究，發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶水解降低抗原性的效果比其他蛋白酶較好[8-11]。但有研究表明，即使堿性蛋白酶也無法完全消除其抗原活性，而且酶解過程產(chǎn)生新的肽段對酶解具有一定的抵抗作用[12-15]。這些抗酶解肽段是否具有抗原活性、其氨基酸是否存在序列性抗原表位、它們來源于大豆蛋白的哪些亞基及其抗酶解的原因等問題，尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究用堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白后，在分析蛋白質(zhì)分子成分和抗原性變化的基礎(chǔ)上，采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）分析酶解后新產(chǎn)生的抗酶解成分的序列特征，并與抗原數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)及大豆分離蛋白的各亞基序列進(jìn)行匹配，從分子水平上解釋酶解不能完全消除大豆蛋白抗原性的原因，為有效酶解大豆蛋白去除其抗原性提供科學(xué)理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 河南陽光油脂公司。

堿性蛋白酶（2.4 AU/g） 丹麥諾維信公司；大豆酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海紀(jì)寧公司；蛋白膠微量回收試劑盒 北京百奧萊博科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（分子質(zhì)量14～97 ku） 上海生物化學(xué)研究所；十二烷基硫酸鈉 美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、二硫蘇糖醇、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺 生工生物工程（上海）股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ5-WS型低速離心機(jī) 湖南湘儀儀器公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；DYY-6C型電泳儀北京六一儀器廠；5800 MALDI-TOF-MS儀 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的水解

取10 g大豆分離蛋白加水配制成5%溶液，加熱至55 ℃，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 8.0。然后按照酶-底物為0.5%的比例加入堿性蛋白酶，反應(yīng)開始并計(jì)時(shí)，整個(gè)反應(yīng)過程中通過滴加2 mol/L NaOH溶液維持反應(yīng)體系中pH值的穩(wěn)定，反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間后，取適量樣品于沸水浴中保溫10 min進(jìn)行滅酶。然后將滅酶后的樣品冷凍干燥并于－20 ℃保存。

1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

根據(jù)Laemmli[16]的方法采用不連續(xù)垂直凝膠電泳系統(tǒng)。濃縮膠5%，電泳電壓80V。分離膠12%，電泳電壓110 V。采用14～97 ku低分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行染色，脫色后，采用Gel-PRO ANALYZER軟件分析。

1.3.3 競爭法ELISA對酶解物抗原活性的測定[17]

采用競爭法ELISA檢測酶解產(chǎn)物的抗原性，具體操作按照ELISA試劑盒說明書的步驟進(jìn)行，計(jì)算出樣品濃度，以抗原剩余率（%）表示酶解效果。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件處理。

1.3.4 胰蛋白酶的膠內(nèi)酶解

將21 ku和23 ku SDS-PAGE蛋白條帶分別進(jìn)行膠內(nèi)酶解，方法參照文獻(xiàn)[18]相關(guān)步驟進(jìn)行操作。酶解后的樣品經(jīng)C18Cartridge脫鹽后，凍干并于－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MALDI-TOF-MS分析[19]

采用配有N2激光（337 nm，3 nm脈沖間隔）的MALDI-TOF-MS對所得肽段進(jìn)行分析。取1 μL肽樣品點(diǎn)加到專用不銹鋼盤中，以α-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)（用量1 μL，配制方法為取5 mg固體基質(zhì)試劑，溶解到0.5 mL 0.1%三氟乙酸和50%乙腈溶液中），點(diǎn)樣后室溫下干燥。用Sigma公司標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量肽進(jìn)行外標(biāo)分析。

采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級質(zhì)譜（MS）掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜（MS2）分析，二級質(zhì)譜（MS2）累計(jì)疊加2 500 次。數(shù)據(jù)圖譜由FlexControl軟件采集，采用Data Explorer V4.5軟件分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫檢索

質(zhì)譜測試原始文件用Mascot 2.2軟件檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)如下：數(shù)據(jù)庫：uniprot Glycine max；搜索類型：（MS+MS2）相結(jié)合；水解用酶：胰蛋白酶；質(zhì)量值：單同位素；蛋白質(zhì)質(zhì)量：無限制；肽質(zhì)量允許量：+100×10－6；肽片段質(zhì)量允許誤差范圍：±0.4 Da；酶切位點(diǎn)數(shù)：1。

1.3.7 肽鏈抗原活性測定

SDS-PAGE膠片上的目的條帶（未染色），采用蛋白膠微量回收試劑盒按照說明書步驟分別將膠中蛋白進(jìn)行回收?；厥盏牡鞍捉?jīng)C18Cartridge脫鹽后用N2吹干于－20 ℃保存。將回收的樣品用10 μL水復(fù)溶，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行抗原性的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解過程中大豆分離蛋白成分的變化

大豆分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解不同時(shí)間后，通過SDS-PAGE方法分析酶解物中組分的變化，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)譜帶發(fā)生了規(guī)律性的變化。酶解10 min 時(shí)，7S蛋白中的α’、α和β三個(gè)亞基都已完全消失，11S球蛋白中的38 ku酸性亞基（圖1A）和21 ku堿性亞基（圖1B）含量也明顯減少，與此同時(shí)，新產(chǎn)生了大量23 ku組分及大量的分子質(zhì)量小于14 ku組分。30 min時(shí)，21 ku不僅沒有繼續(xù)減少，而且相對于10 min時(shí)有少量增加的跡象，表明酶解過程中有新生成的21 ku組分。90 min時(shí)，38 ku的酸性亞基已完全消失。直到120 min時(shí)，21 ku和23 ku組分含量基本保持不變。從30～120 min酶解的趨勢看，21 ku和23 ku組分始終沒有將被酶解減少的跡象。

以上結(jié)果表明，大豆分離蛋白中的7S蛋白很容易被堿性蛋白酶水解，而11S球蛋白的堿性亞基不易被水解，新生成的21 ku和23 ku肽段對堿性蛋白酶的抗酶解現(xiàn)象更明顯。

2.2 酶解物抗原活性分析

蛋白質(zhì)的抗原性取決于其分子結(jié)構(gòu)，酶解被認(rèn)為是消除蛋白質(zhì)抗原性的有效手段。但大量研究表明，抗原蛋白質(zhì)分子中的抗原表位分為構(gòu)象型和序列性兩種類型[20-21]。構(gòu)象型抗原表位隨著蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化消失明顯，而序列性表位則相對穩(wěn)定，即使蛋白質(zhì)分子受到酶解處理，只要該氨基酸序列不被切斷，則仍可能具有抗原活性。

為了解大豆分離蛋白酶解過程中抗原活性的變化，采用競爭法ELISA專用試劑盒測定不同酶解時(shí)間后大豆分離蛋白酶解物的抗原活性（圖2）。之所以采用競爭法ELISA分析，是基于大豆蛋白經(jīng)過酶解后分子質(zhì)量降低，該法可以測定出樣品中小分子抗原的存在，而且靈敏度很高。

圖2 不同酶解時(shí)間大豆分離蛋白抗原活性的變化Fig. 2 Changes in antigenicity during the hydrolysis of soybean protein isolate

從圖2可以看出，在酶解開始10 min后，抗原活性有明顯下降的趨勢，此階段也是7S蛋白中α’、α和β三個(gè)亞基被迅速酶解的時(shí)間（圖1），可能在酶解的前10 min，抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，破壞了構(gòu)象表位。在10～30 min時(shí)，抗原活性下降的趨勢有所減弱，可能是隨著構(gòu)象表位的減少，酶與抗原蛋白的結(jié)合位點(diǎn)也隨之減少，酶解速率下降減弱了抗原活性的下降趨勢，也可能是在構(gòu)象表位進(jìn)一步遭到破壞后暴露出了抗原蛋白空間內(nèi)部的線性表位，在一定程度上抑制了抗原活性下降的趨勢[22]。在30～120 min時(shí)，抗原活性下降的趨勢進(jìn)一步減弱，并逐漸趨于平緩，此變化規(guī)律與酶解過程中蛋白質(zhì)分子亞基的變化趨勢相似，可能此時(shí)只剩余抗原蛋白中的線性表位，且這些線性表位不易被堿性蛋白酶快速水解破壞。直到酶解120 min時(shí)，大豆分離蛋白的抗原活性也未完全消失，意味著酶解物分子中可能仍有線性表位的存在。據(jù)報(bào)道，大豆11S球蛋白堿性亞基（圖1中B條帶）很少能與過敏者血清的IgE抗體發(fā)生結(jié)合而引起過敏反應(yīng)[23-25]。所以酶解過程中抗原性的變化基本與該亞基沒有關(guān)系，水解120 min后酶解物所殘留的抗原活性都來源于新生成的組分。

2.3 MALDI-TOF-MS肽段分析

為進(jìn)一步探討酶解過程中新形成的具有抵抗堿性蛋白酶解特點(diǎn)的21 ku和23 ku肽分子特征與酶解物中殘留抗原性的關(guān)系，分別對SDS-PAGE中21 ku和23 ku譜帶（圖1）進(jìn)行切膠回收，并采用胰蛋白酶對回收的兩個(gè)膠條分別進(jìn)行膠內(nèi)酶解，將膠內(nèi)酶解物用MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析，見圖3。將肽段的氨基酸序列與抗原數(shù)據(jù)庫http：//www.immuneepitope.org中抗原表位的氨基酸序列進(jìn)行匹配，結(jié)果見表1、2。

圖3 酶解120 min時(shí)21 ku（a）和23 ku（b）的MALDI-TOF-MSFig. 3 MALDI-TOF-MS of 21 ku (a) and 23 ku (b) peptides obtained in the 120 min hydrolysate

從圖3a可以看出，21 ku經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶解后產(chǎn)生了很多肽段。通過Mascot軟件將MALDI-TOF-MS檢測到的肽段序列與抗原數(shù)據(jù)庫中抗原表位序列匹配發(fā)現(xiàn)：MALDI-TOF-MS檢測到21 ku中有16 條肽段（共檢測到25 條）的氨基酸序列與抗原表位序列有部分序列重合，此結(jié)果說明：21 ku肽鏈經(jīng)胰蛋白酶進(jìn)行膠內(nèi)酶解后，大部分完整的抗原表位都已被破壞。

表1 肽段21 ku中檢測到的氨基酸序列和對應(yīng)抗原序列Table 1 Identi fied peptide sequences in 21 ku fragment and corresponding antigen sequences

表2 肽段23 ku中檢測到的氨基酸序列和對應(yīng)抗原序列Table 2 Identifified peptides sequences in 23 ku fragment and corresponding antigen sequences

為進(jìn)一步分析未經(jīng)胰蛋白酶水解的21 ku肽鏈中是否存在完整的抗原表位序列，根據(jù)胰蛋白酶水解位點(diǎn)是賴氨酸（K）和精氨酸（R）羧基端的特點(diǎn)，將已檢出抗原序列片段進(jìn)行拼接，并與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）中大豆蛋白氨基酸序列進(jìn)行匹配確定出其所在原大豆分離蛋白氨基酸序列的位置，再與抗原數(shù)據(jù)庫的抗原表位氨基酸序列匹配，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 個(gè)完整的序列表位（圖4）：一個(gè)是表1中含有部分抗原序列的VLQRFNQR和SPQLQNLRDYR拼接后的氨基酸序列，與β-伴大豆球蛋白α-亞基中的VLQRFNQRSPQLQNLRDYR（序號為216～234）氨基酸序列重合。經(jīng)抗原數(shù)據(jù)庫查詢，這個(gè)序列中包含有完整的抗原表位序列LQRFNQRSPQLQNLR。另一個(gè)是表1中TISSEDKPFNLR、SRDPIYSNK、LGKFFEITPEK和FFEITPEKNPQLR肽段經(jīng)胰蛋白酶水解位點(diǎn)拼接后的氨基酸序列，與β-伴大豆球蛋白中α-亞基中的TISSEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEK NPQLR（序列為398～434）的氨基酸序列重合。經(jīng)抗原數(shù)據(jù)庫查詢，此序列中包含有完整的抗原表位序列SEDKPFNLRSRDPIYSNKLGKFFEITPEKN。以上結(jié)果說明：酶解物中仍殘留抗原性的原因之一是酶解新產(chǎn)生的21 ku肽鏈中含有2 個(gè)完整的抗原表位，且此21 ku肽鏈來源于β-伴球蛋白的α-亞基。

圖4 21 ku亞基中鑒定出包含完整抗原的肽段序列以及所在大豆分離蛋白的亞基位置Fig. 4 Complete antigen sequence in 21 ku peptide and its location in soybean protein

從圖3b可以看出，23 ku肽鏈經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)酶解后也產(chǎn)生了很多肽段。按照前述相同的分析方法處理后發(fā)現(xiàn)，有12 條肽段（共檢測到17 條）含有抗原表位部分序列，其中有3 條肽段（表2中相對分子質(zhì)量為1 010、1 051和1 618對應(yīng)的肽段）均分別與兩個(gè)以上的抗原表位部分序列重合。但是，將胰蛋白酶水解位點(diǎn)拼接后再與抗原數(shù)據(jù)庫中的抗原序列進(jìn)行匹配，未發(fā)現(xiàn)含有完整抗原表位序列的肽段。意味著未經(jīng)胰蛋白酶水解的23 ku肽鏈中，沒有與完整抗原表位序列相匹配的氨基酸序列。推測大豆分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解120 min后所產(chǎn)生的23 ku組分中不存在抗原活性。

另外，在該蛋白酶解產(chǎn)物中還存在一些相對分子質(zhì)量小于21 ku的組分（圖1）。由于SDS-PAGE中這些組分的顏色較淺（意味著蛋白含量較少）且譜帶特征不明顯（分散），暫未對這些組分進(jìn)行研究。這些組分是否含有序列型抗原表位，有待于進(jìn)一步深入分析。

2.4 肽鏈抗原性分析

為驗(yàn)證21 ku和23 ku肽段是否存在抗原性，本研究采用蛋白膠微量回收試劑盒對膠內(nèi)21 ku和23 ku蛋白分別回收，并采用競爭法ELISA試劑盒對其進(jìn)行抗原活性的測定，計(jì)算其抗原剩余率分別為15.7%和2.1%。

21 ku組分有相對較高的抗原性（為大豆分離蛋白抗原性的15.7%），這與該組分中檢測到存在完整抗原表位的結(jié)果一致。在23 ku組分的抗原剩余率僅為2.1%，而質(zhì)譜分析中未檢測出表位序列，這與兩個(gè)因素有關(guān)：一是23 ku中可能存在未知的序列表位，相關(guān)數(shù)據(jù)庫中沒有列入，所以無法比對；二是可能與大豆蛋白分子中糖鏈的存在有關(guān)。β-伴大豆球蛋白是一類糖蛋白[26]，有些糖蛋白的糖鏈本身就是抗原[27-29]，且有研究表明大豆抗原蛋白經(jīng)N-糖苷酶脫去糖鏈后其抗原性降低[30-31]。上述23 ku組分抗原性是否與糖鏈有關(guān)，本課題將進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 論

隨著酶解時(shí)間的延長，大豆分離蛋白各組分及其酶解物的抗原活性發(fā)生規(guī)律性變化，且二者存在很大的相似性。酶解前30 min時(shí)，7S蛋白中α’、α和β三個(gè)亞基迅速被降解，且產(chǎn)生了21 ku和23 ku新組分，直至120 min，這些組分依然存在。競爭法ELISA分析表明：在酶解最初的30 min內(nèi)抗原活性快速降低，之后降低趨勢減緩，直到酶解120 min時(shí)，依然有28%的抗原剩余率。將21 ku和23 ku的電泳譜帶分別經(jīng)胰蛋白酶水解后采用MALDITOF-MS分析，其結(jié)果與抗原數(shù)據(jù)庫、大豆蛋白數(shù)據(jù)庫中相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行匹配表明：21 ku組分中含有兩個(gè)完整的序列型表位，且這兩個(gè)序列型表位均來自β-伴大豆球蛋白的α-亞基；在23 ku經(jīng)胰蛋白酶水解后雖有片段與抗原表位部分序列相同，但未發(fā)現(xiàn)有完整的序列型表位存在。經(jīng)對21 ku和23 ku組分單獨(dú)進(jìn)行抗原性測定發(fā)現(xiàn)，21 ku組分中有相對較高的抗原性，與上述21 ku中存在完整抗原表位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合，而23 ku依然表現(xiàn)出微弱的抗原性，是否與糖蛋白中糖鏈有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。上述結(jié)果一定程度解釋了酶解物仍有抗原活性存在的部分原因，也揭示了新生成的具有抗原活性表位肽鏈的分子來源。