錢 晶，歐陽(yáng)偉，王晶宇，姚凌云，吳世妍，王曉麗，潘群興，夏興霞，諸玉梅，劉 軍，劉國(guó)芳，王永山

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院，南京210008；3. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，鎮(zhèn)江212400）

隨著社會(huì)的進(jìn)步、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的提高，寵物飼養(yǎng)量在全國(guó)快速增加，目前我國(guó)寵物犬約有1.5億只，寵物貓約有3000萬(wàn)只[1]。淺表皮膚真菌病是寵物犬、貓臨床上的常見(jiàn)皮膚癬菌病，表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)明顯化膿性滲出、結(jié)痂、潰瘍、斑塊化脫毛、角質(zhì)化、毛囊炎及各種癬等，主要由犬小孢子菌（Microsporum canis，Mc）、石膏樣小孢子菌（Microsporum gypseum，Mg）和須毛癬菌（Trichophyton mentagrophytes，Tm）單獨(dú)或混合感染引起[2]。犬小孢子菌感染在犬皮膚真菌病中占50%～70%，在貓皮膚真菌病中高達(dá)90%以上[3-4]。石膏樣小孢子菌屬嗜土壤菌，寵物容易從污染土壤或草叢中攜帶，經(jīng)常造成面部或四肢的膿皰，并伴隨角質(zhì)化病灶[5]。須毛癬菌，又名石膏樣毛癬菌，常以復(fù)合體形式引發(fā)皮膚癬病。同時(shí)，犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌和須毛癬菌屬于重要的人獸共患病原菌，可引起人感染皮膚癬菌病[6]，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了較大威脅。

目前，真菌分型鑒定通常采用分離培養(yǎng)及菌落表型特征分析[7]，但是分離培養(yǎng)時(shí)間周期長(zhǎng)，人為誤差大，對(duì)于混合真菌樣品難以區(qū)分，很難對(duì)疑似菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別。近年來(lái)，分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，在一定程度上為真菌種屬鑒別以及基因分型提供了有力支撐[8]，包括線粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析[9]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析[10]以及基于PCR的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析[11]和隨機(jī)引物法[12]等，但這些方法存在培養(yǎng)物純度難以達(dá)到要求，操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)。在實(shí)踐應(yīng)用中，采用快速、便捷的檢測(cè)手段對(duì)皮膚淺表真菌病的篩查與鑒定具有重要的指導(dǎo)意義。PCR的應(yīng)用使真菌鑒定更加便捷、特異和靈敏，其中多重PCR通過(guò)多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸條帶，可達(dá)到同時(shí)鑒定區(qū)分混合真菌的目的。

PCR擴(kuò)增的目的基因是明確物種的關(guān)鍵因素，真菌rRNA為串聯(lián)重復(fù)序列，包括保守性強(qiáng)的28S、18S、5.8S、5S和可變性高的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（nontranscribed spacer，NTS），其中ITS是目前公認(rèn)的真菌種間和種內(nèi)基因分型的最可靠靶基因[13-14]。本研究根據(jù)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌ITS的序列差異設(shè)計(jì)4條引物，通過(guò)條件優(yōu)化，建立一種可同時(shí)檢測(cè)這3種病原真菌的多重PCR方法，為寵物淺表真菌病的快速診斷提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 菌種 犬小孢子菌（ATCC 36299）、石膏樣小孢子菌（ATCC 24103）、須毛癬菌（ATCC 28185）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保藏中心；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌和沙門(mén)氏菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 PCR酶及緩沖液（RR53A）購(gòu)自寶生物公司，DNA緩沖液（400 mmol/L Tris-HCl、60 mmol/L EDTA、150 mmol/L NaCl、1%SDS，pH 8.0）、醋酸鉀（5 mol/L，pH 4.8）為本實(shí)驗(yàn)室自行配制；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基115℃滅菌15 min；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)查閱文獻(xiàn)，基于GenBank中犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌ITS序列差異，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)4條引物，其中包含1條通用上游引物和3條特異性下游引物，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.4 真菌基因組DNA的提取 將真菌接種至沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)7 d后收集菌體并研磨處理，沉淀用500 μL DNA緩沖液重懸，室溫靜置10 min；加入150 μL 醋酸鉀充分混勻，10 000×g離心5 min去除蛋白沉淀，上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管；加入等體積異丙醇，顛倒混勻，10 000×g離心5 min，棄上清；加入700 μL 70%乙醇，10 000×g離心5 min，棄上清；沉淀在室溫下晾干，加入30 μL蒸餾水溶解核酸。

1.5 多重PCR反應(yīng)體系的建立 PCR反應(yīng)體系：ExTaqMix（2×）12.5μL、4條引物（5 μmol/L）各1 μL、模板2 μL，補(bǔ)足ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃～62℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.6 特異性檢測(cè) 按照優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系與條件對(duì)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌、沙門(mén)氏菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證多重PCR反應(yīng)的特異性。

1.7 靈敏性檢測(cè) 將3株真菌DNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋，犬小孢子菌模板濃度為12.6×100～12.6×10-6μg/μL；石膏樣小孢子菌模板濃度為8.8×100～8.8×10-6μg/μL；須毛癬菌模板濃度為13.6×100～13.6×10-6μg/μL，以不同稀釋倍數(shù)的模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，測(cè)定其靈敏性。

1.8 重復(fù)性檢測(cè) 根據(jù)建立的多重PCR分別對(duì)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，各重復(fù)5次檢驗(yàn)其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 人工模擬樣品的檢測(cè) 將3種真菌菌株進(jìn)行單獨(dú)和混合處理，然后提取相應(yīng)基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.10 臨床樣品的收集與檢測(cè)

1.10.1 臨床樣品的收集 27份人臨床皮屑樣品由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚科劉軍博士提供，43份寵物犬、貓毛發(fā)樣品由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院劉國(guó)芳博士提供。

1.10.2 臨床樣品的檢測(cè) 臨床樣品基因組DNA的提取參照方法1.4，并用建立的多重PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)真菌分離培養(yǎng)法[15]進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR反應(yīng)條件的確定 PCR反應(yīng)參數(shù)中，引物的退火溫度起到關(guān)鍵性作用。在多重PCR 25 μL反應(yīng)體系中，有效退火溫度為56℃～62℃，見(jiàn)圖1。確定的多重PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

2.2 多重PCR反應(yīng)的特異性檢測(cè) 所建立的多重PCR方法對(duì)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌均能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶，相互間無(wú)交叉反應(yīng)，并且對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母菌、沙門(mén)氏菌基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該多重PCR方法特異性良好（圖2）。

2.3 多重PCR反應(yīng)的靈敏性檢測(cè) 所建立的多重PCR方法擴(kuò)增Mc的檢測(cè)靈敏度為12.6 pg/μL，Mg的檢測(cè)靈敏度為8.8 pg/μL，Tm的檢測(cè)靈敏度為13.6 pg/μL，見(jiàn)圖3。

2.4 多重PCR反應(yīng)的重復(fù)性檢驗(yàn) 應(yīng)用建立的多重PCR方法分別對(duì)Mc、Mg和Tm基因組DNA重復(fù)檢測(cè)5次，結(jié)果均能擴(kuò)增出目的條帶，見(jiàn)圖4，表明該方法檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。

圖1 不同退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of different annealing temperature on PCR reaction

圖2 多重PCR特異性檢測(cè)Fig.2 Specifi c test of multiplex PCR

圖3 多重PCR靈敏度檢測(cè)Fig.3 Sensitivity test of multiplex PCR

圖4 多重PCR重復(fù)性檢測(cè)Fig.4 Repeatability test of multiplex PCR

2.5 人工模擬樣品的檢測(cè) 應(yīng)用建立的多重PCR方法對(duì)人工模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，3種真菌單獨(dú)或混合提取的基因組DNA均可擴(kuò)增出與預(yù)期的條帶，見(jiàn)圖5。

圖5 多重PCR檢測(cè)模擬樣品Fig.5 Detection of simulated samples by multiplex PCR

2.6 臨床樣品的檢測(cè) 用建立的多重PCR方法對(duì)27份人臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示人皮屑樣品中陽(yáng)性檢出率為74.07%（20/27），其中Mc檢出率為59.26%（16/27），Mg檢出率為29.63%（8/27），Tm檢出率為7.41%（2/27）；對(duì)43份寵物犬、貓毛發(fā)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示寵物毛發(fā)樣品中陽(yáng)性檢出率為83.72%（36/43），其中Mc檢出率為69.77%（30/43），Mg檢出率為58.14%（25/43），Tm檢出率為11.63%（5/43）。采用常規(guī)真菌分離培養(yǎng)法從陽(yáng)性樣品中獲得10株致病性真菌，分離率僅為17.86%（10/56），表明該多重PCR的靈敏性高于常規(guī)方法。

采用多重PCR檢測(cè)分離獲得的10株真菌，1株分離株擴(kuò)增后出現(xiàn)2個(gè)特異性條帶，說(shuō)明該樣品同時(shí)存在Mc和Mg感染，而常規(guī)方法的鑒定結(jié)果僅為Mg感染；其余9個(gè)樣品的種屬鑒定比對(duì)結(jié)果均一致，見(jiàn)圖6和表2，可見(jiàn)，多重PCR的敏感性優(yōu)于常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定方法。

圖6 多重PCR檢測(cè)臨床分離株Fig.6 Detection of clinical isolates by multiplex PCR

表2 多重PCR與真菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果比較Table 2 Comparison of multiplex PCR and conventional fungal culture identifi cation

3 討論

寵物皮膚病一年四季均可發(fā)生，根據(jù)發(fā)病原因可大致分為真菌性、細(xì)菌性、寄生蟲(chóng)性、病毒性、皮膚過(guò)敏性、自身免疫性、內(nèi)分泌性和代謝性皮膚病等[16-17]。目前，寵物犬貓皮膚真菌病較為常見(jiàn)，以幼齡犬貓、免疫力低下和長(zhǎng)毛的犬貓發(fā)病率最高。感染的犬貓經(jīng)常抓撓致使皮膚破潰，從而在病灶部位反復(fù)感染。淺表真菌也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能的下降，進(jìn)而加劇寄生蟲(chóng)或細(xì)菌等病原的感染，這給寵物的生活質(zhì)量和觀賞性造成了嚴(yán)重的影響[3,18-19]。同時(shí)，犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌均可在動(dòng)物與人類之間發(fā)生接觸性傳播，對(duì)公共衛(wèi)生造成危害[6]。付相鈺等[20]從家養(yǎng)寵物檢測(cè)出的致病癬菌與頭癬患者種類相同，證實(shí)家養(yǎng)寵物是人類頭癬的主要傳染源。本研究中人臨床樣品真菌檢出率（74.07%）與寵物臨床樣品檢出率（83.72%）均處于較高水平，推測(cè)這些致病性真菌在人與寵物中處于較高流行態(tài)勢(shì)。其中犬小孢子菌檢出率最高，其次為石膏樣小孢子菌和須毛癬菌，這與皮膚淺表真菌病感染病原種類結(jié)構(gòu)相符[3,18-20]。

目前，臨床上診斷皮膚真菌病仍采用伍氏燈照射、顯微鏡檢測(cè)、皮膚組織病理學(xué)檢查和真菌培養(yǎng)等[21-22]，這些檢測(cè)方法存在一定的局限性。例如，真菌分離培養(yǎng)方法操作繁瑣，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，分離率低。本研究中真菌培養(yǎng)的分離率僅為17.86%（10/56），且該方法依賴主觀判斷，常出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。另外，犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌等真菌生長(zhǎng)特性和表型具有相似性，并且這3種致病性真菌的混合感染現(xiàn)象較為常見(jiàn)，通過(guò)常規(guī)鑒定手段難以區(qū)分。同時(shí)，真菌感染早期基本無(wú)明顯癥狀，常規(guī)檢測(cè)方法難以及時(shí)診斷。PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)，已成為鑒別診斷多種病原物種的重要手段，在此基礎(chǔ)上改進(jìn)并發(fā)展的多重PCR方法在混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

本研究基于真菌ITS的序列差異，通過(guò)篩選特定位點(diǎn)引物序列擴(kuò)增出大小不一的目的條帶，既具有種屬特異性又滿足種間特異性。建立的多重PCR方法特異性強(qiáng)，不僅對(duì)人工模擬的單獨(dú)或混合樣品檢測(cè)準(zhǔn)確，而且從臨床樣品中擴(kuò)增出多個(gè)目的條帶，說(shuō)明樣品中存在混合感染，而這種混合感染現(xiàn)象在臨床上也較為多見(jiàn)[22]。同時(shí)本研究建立的多重PCR靈敏性高，檢測(cè)下限可達(dá)pg級(jí)別，檢出率顯著高于常規(guī)真菌培養(yǎng)法。

綜上所述，本研究根據(jù)犬小孢子菌、石膏樣小孢子菌、須毛癬菌ITS序列差異所建立的多重PCR方法能同時(shí)檢測(cè)3種致病性真菌，操作簡(jiǎn)便，靈敏性高，特異性強(qiáng)，彌補(bǔ)了常規(guī)檢測(cè)方法的局限性，這對(duì)致病性真菌早期潛伏、隱性感染、混合感染的診斷以及配套治療十分重要，為寵物犬貓皮膚真菌病的快速診斷及防治提供了新策略。